【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一株表达基因3型鸭甲型肝炎病毒vp1共识蛋白的重组杆状病毒及其在鸭甲型肝炎亚单位疫苗制备中的应用。
技术介绍
1、鸭甲型病毒性肝炎是由鸭甲型肝炎病毒(dhav)引起的雏鸭的急性、高度致死性传染病，是危害养鸭业的头号杀手。很长一段时期内，基因1型(dhav-1)在我国鸭群中占主导地位，自2013年开始，基因3型(dhav-3)传入我国并在鸭群中迅速传播。目前，dhav-1与dhav-3在鸭群中共同流行，而dhav-3正逐渐占据优势流行地位。
2、与其他小rna病毒一样，dhav的进化速率和病毒之间的重组率较高。不同研究表明，dhav自出现以来，经过几十年的流行，已发生了显著的遗传变异。wen等报道，dhav-1分离株已进化成为两个分支，2010-2012年间流行的病毒与早期毒株相比，在遗传水平和血清学反应性上出现了明显的变异。近年来，dhav-3已经成为优势基因型，也出现了显著的遗传变异。此外，yang等的研究显示，dhav频繁发生基因重组事件，尤其是基因1型与3型病毒之间的基因重组，使病毒基因组和生物学特性更具复杂性，为疫病防控带来了挑战。
3、疫苗接种是鸭甲型病毒性肝炎防控的重要手段。目前，临床上主要使用dhav减毒活疫苗与灭活疫苗进行鸭群的免疫接种。减毒活疫苗是将野毒株在鸡胚中进行多次连续传代致弱而获得，存在费时费力、随机性较高、有毒力返强风险等缺陷。灭活疫苗是将dhav野毒株在鸡胚中扩增后，用化学物质处理消除病毒感染性，再加入佐剂制备而获得。灭活疫苗存在病毒灭活不完全的风
4、基于细胞表达系统的亚单位疫苗是解决现有dhav疫苗技术问题的有效途径之一。杆状病毒表达系统是用表达外源基因的重组杆状病毒感染昆虫细胞，表达外源抗原蛋白的高效技术平台，具有以下优点：1)杆状病毒只感染节肢动物，不感染脊椎动物，安全性较高；2)昆虫细胞可通过发酵工艺大规模培养，成产成本低、均一度高；3)杆状病毒基因组容量大，可容纳多个外源基因；4)利用杆状病毒极晚期启动子表达外源蛋白，可达到较高的抗原产量。
5、针对病毒变异的问题，研究者已开发了不同的策略进行疫苗的设计以扩大疫苗的覆盖范围，包括祖先序列、马赛克序列、共识序列(consensus)、嵌合序列等。其中，基于保护性基因共有序列的疫苗对变异毒株有良好的反应性，是应对病毒遗传变异的有效手段。对于艾滋病病毒和流感病毒等高度变异的病毒，不同团队利用不同的序列分析与比对策略获得了病毒保护性基因的共识序列，并基于共识序列构建了疫苗候选株。研究表明，表达共识基因的疫苗能够激发广谱性免疫反应与保护，提高了疫苗应对病毒变异的能力。但是，目前还没有关于dhav共有序列及相关广谱疫苗的研究。
6、市场上的商品化dhav疫苗均是在鸡胚中进行生产的，并且仅能针对与疫苗毒株亲缘关系近的某些毒株，一旦病毒发生变异或重组，疫苗的保护效力则会受到影响。但是遗憾的是，目前尚没有能够覆盖不同毒株的、不依赖鸡胚的新型dhav疫苗。研制具有这些特性的新型dhav疫苗对于亚病毒性肝炎的防控具有较大的意义。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供了一株能够表达dhav-3vp1共识蛋白的重组杆状病毒，基于杆状病毒制备的灭活抗原能够激发雏鸭的抗体应答，并提供良好的保护。
2、本专利技术提供的技术方案如下：
3、一种dhav-3vp1共识蛋白，所述dhav-3vp1共识蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述dhav-3vp1共识蛋白的蛋白n-端添加了杆状病毒自身的蜕化类固醇udp-葡糖转移酶(egt)的信号肽。
4、本专利技术还提供一种核苷酸分子，所述核苷酸分子编码上述的dhav-3vp1共识蛋白，所述核苷酸分子的序列如seq id no.13所示。
5、本专利技术还提供一种重组质粒，所述重组质粒包含上述的核苷酸分子。
6、进一步的，包括以下步骤：将含有上述核苷酸分子的质粒和转移载体pvl1393经xba i和not i双酶切后，回收目的片段，用t4连接酶连接；将连接产物转化t1感受态细胞；用axygen质粒提取试剂盒提取质粒，用kpn i酶切后鉴定，得到重组质粒。
7、本专利技术还提供一株表达基因3型鸭甲型肝炎病毒vp1共识蛋白的重组杆状病毒的构建方法，包括以下步骤：将上述的重组质粒和线性化的杆状病毒基因组dna共转染宿主细胞，得到表达基因3型鸭甲型肝炎病毒vp1共识蛋白的重组杆状病毒。
8、进一步的，所述宿主细胞为sf9细胞。
9、本专利技术还提供一株表达基因3型鸭甲型肝炎病毒vp1共识蛋白的重组杆状病毒，由上述方法制备得到。
10、本专利技术还提供一种抗原，所述抗原采用上述的表达基因3型鸭甲型肝炎病毒vp1共识蛋白的重组杆状病毒制备得到。
11、本专利技术还提供一种试剂盒，所述试剂盒包含上述的抗原。
12、本专利技术还提供上述的表达基因3型鸭甲型肝炎病毒vp1共识蛋白的重组杆状病毒在制备dhav-3亚单位疫苗中的应用。
13、本专利技术通过序列比对分析的方法获得一条dhav-3vp1蛋白的氨基酸共识序列(seqid no.1)。
14、进一步地，在vp1共识蛋白n-端添加杆状病毒自身的蜕化类固醇udp-葡糖转移酶(egt)的信号肽，以增减目的蛋白的表达量。
15、进一步地，合成编码上述vp1共识蛋白的核苷酸序列(seq id no.13)，并将其密码子优化以适应昆虫细胞sf9。将vp1基因克隆至转移载体pvl1393，克隆位点为xba i与noti。
16、进一步地，将重组中间质粒与杆状病毒线性化基因组共转染sf9细胞，拯救重组杆状病毒。所述杆状病毒基因组为苜蓿银纹夜蛾多角体病毒的线性化基因组。
17、本专利技术的另一目的是用上述的重组杆状病毒制备含有vp1蛋白的抗原。
18、通过将重组杆状病毒接种sf9悬浮细胞，制备vp1蛋白表达产物，经二乙烯亚胺灭活后，添加佐剂制备抗原。所述佐剂为seppic montanide isa78vg佐剂。
19、本专利技术的另一目的是提供上述重组杆状病毒在制备dhav-3亚单位疫苗中的应用。
20、将制备的抗原进行雏鸭的免疫攻毒试验，评价基于重组杆状病毒的vp1亚单位疫苗对dhav-3的保护效力。
21、有益效果
22、一方面，现有疫苗仅能覆盖少部分毒株，且难以应对可能发生的病毒变异与重组；本专利技术利用生物信息学方法获得了一条vp1共识序列，该序列与已公布的大多数dhav-3vp1序列具有较高的同源性，且潜在的抗原表位与dhav-3毒株vp1的表位高度同源，显示其具有覆盖变异毒株与重组毒株的能力。另一方面，现有疫苗高度依赖传统的鸡胚生产系本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种DHAV-3VP1共识蛋白，其特征在于，所述DHAV-3VP1共识蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.1所示，所述DHAV-3VP1共识蛋白的蛋白N-端添加了杆状病毒自身的蜕化类固醇UDP-葡糖转移酶的信号肽。
2.一种核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子编码如权利要求1所述的DHAV-3VP1共识蛋白，所述核苷酸分子的序列如SEQ ID NO.13所示。
3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包含权利要求2所述的核苷酸分子。
4.根据权利要求3所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有权利要求2所述核苷酸分子的质粒和转移载体pVL1393经Xba I和Not I双酶切后，回收目的片段，用T4连接酶连接；将连接产物转化T1感受态细胞；用Axygen质粒提取试剂盒提取质粒，用Kpn I酶切后鉴定，得到重组质粒。
5.一株表达基因3型鸭甲型肝炎病毒VP1共识蛋白的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求3所述的重组质粒和线性化的杆状病毒基因组DNA共转染宿主细胞，得到表达基因3型鸭甲型肝
6.根据权利要求5所述的表达基因3型鸭甲型肝炎病毒VP1共识蛋白的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于，所述宿主细胞为Sf9细胞。
7.一株表达基因3型鸭甲型肝炎病毒VP1共识蛋白的重组杆状病毒，其特征在于，由权利要求5或6所述方法制备得到。
8.一种抗原，其特征在于，所述抗原采用权利要求7所述的表达基因3型鸭甲型肝炎病毒VP1共识蛋白的重组杆状病毒制备得到。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求8所述的抗原。
10.权利要求7所述的表达基因3型鸭甲型肝炎病毒VP1共识蛋白的重组杆状病毒在制备DHAV-3亚单位疫苗中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种dhav-3vp1共识蛋白，其特征在于，所述dhav-3vp1共识蛋白的氨基酸序列如seqid no.1所示，所述dhav-3vp1共识蛋白的蛋白n-端添加了杆状病毒自身的蜕化类固醇udp-葡糖转移酶的信号肽。
2.一种核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子编码如权利要求1所述的dhav-3vp1共识蛋白，所述核苷酸分子的序列如seq id no.13所示。
3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包含权利要求2所述的核苷酸分子。
4.根据权利要求3所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有权利要求2所述核苷酸分子的质粒和转移载体pvl1393经xba i和not i双酶切后，回收目的片段，用t4连接酶连接；将连接产物转化t1感受态细胞；用axygen质粒提取试剂盒提取质粒，用kpn i酶切后鉴定，得到重组质粒。
5.一株表达基因3型...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡增垒，胡娇，张艳焱，何海蓉，李建梅，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：
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