超灵敏量子点微球免疫层析试纸条快速检测方法技术

本发明专利技术涉及检测方法，一种超灵敏量子点微球免疫层析试纸条快速检测方法。现有技术的缺点是：由于样品检测限度要求高；样品成分复杂，前处理难度大；检测灵敏度无法满足人们的要求。本发明专利技术方法为制备二氧化硅纳米粒子；将氨基化二氧化硅纳米粒子与抗体在缩合剂的作用下３７℃孵育１－１０ｈ，高速离心１－４次除去未结合抗体与缩合剂；将离心后的沉淀物复溶，加入缩合剂及羧基化水溶性量子点，高速离心除去游离的量子点与缩合剂；制得二氧化硅／量子点复合微球探针；组建免疫层析试纸条体系。本发明专利技术的优点是：检测方法简便、结果准确、直观；灵敏度高；价格低廉；可做半定量检测、定量检测；应用广泛。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测方法，具体地说是一种超灵敏量子点微球免疫层析试纸条快速检 测方法。
技术介绍
免疫层析试纸条检测是一种快速、简便、灵敏、直观、价格低廉，可根据需要随时进 行现场检测的方法。具有其它检测方法例如气相色谱法、高效液相色谱法、气质联用色谱 法、液质联用色谱法、毛细管电泳等仪器检测方法不具备的优点。在检测技术中处于重要的 地位，也是对传统检测和仪器检测的良好补充。尤其在科学技术发展，生活水平提高的当 代，人类重大疾病，环境污染，食品安全等问题日益受到极大的关注，免疫层析检测技术更 加具有重要的作用。目前，免疫层析产品主要为胶体金免疫层析试纸条，其最早应用于医学检验，在早 孕检测中应用取得了极大的成功；随后在各个领域迅速被扩大应用。在毒品检测、环境检 测、食品安全检测领域得到了迅速的推广和应用。现有免疫层析检测技术的缺点是由于食 品安全检测、农药、兽药残留检测限度要求极度苛刻；同时食品类物质如肉类、禽类、果蔬、 谷物等成分复杂，前处理难度大；胶体金免疫层析检测灵敏度往往无法满足人们的要求。因 此专利技术一种灵敏度高、检测简便、直观、价格低廉的免疫层析检测方法是十分重要的。量子点是近20年来发展起来的半导体纳米晶材料，它具有如下特点1、不同粒 径大小的量子点具有不同的颜色，激发量子点的波长范围很宽，且连续分布，可以用同一波 长的光激发不同大小的量子点而获得多种颜色标记，是一类理想的荧光探针。2、被激发的 量子点所发射的荧光谱峰狭窄而对称，同时使用不同光谱特征的量子点发射光谱不出现交 叠；使生物分子的定量检测和多组分检测变得容易。3、量子点探针的荧光强度比最常用的 罗丹明6G染料高20倍；稳定性是罗丹明6G的100倍以上；可以经受反复多次激发，不易发 生荧光淬灭，光化学稳定性高，不易分解。由于半导体纳米晶材料具有这些优良性能使得它为检测与诊断提供了有力工具。 近年来从细胞标记应用已逐渐开始向多个领域的检测与诊断方向发展。由于量子点一般 粒径微小，只有I-IOnm左右，单个量子点发光强度有限，单个量子点与抗体相偶联，在实际 应用中灵敏度远远不够。因此想要得到更高的发光强度，不仅是要提高单个量子点的荧光 量子产率，更重要的是将多个量子点形成尺寸较大的微球，使得每个球体上具有大量的量 子点；同时不能造成荧光强度的猝灭。将量子点包裹成球通常的做法是用反相微乳液法或 Stsber专利技术的Steber法，将多个量子点包裹进二氧化硅纳米粒子中。应用这种方法得到 的硅包量子点微球因为静电排斥只能包裹少量量子点，同时因为反应中试剂的作用，造成 荧光强度很大的猝灭，无法得到较高的灵敏度。中国专禾Ij200610024086. 7,200810045548. 2,200810041133. 8,200810227473. X、 200810186010. 3都不同程度的涉及量子点免疫层析试纸条检测方法，由于选用的都为单个 量子点或者核壳型量子点，即使应用包裹技术，灵敏度也受到很大的限制。为了提供一种灵敏度高、检测简便、直观、价格低廉、应用广泛的免疫层析检测方 法，专利技术一种，对于人类重大疾病，环境污 染，食品安全的检测是十分必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种灵敏度高、检测简便、直观、价格低廉、应用广泛的超灵 敏量子点微球免疫层析试纸条快速检测方法。本专利技术的目的是这样实现的一种，包括以下步骤(1)制备氨基化二氧化硅纳米粒子A、由表面活性剂、油相、水相、助剂配制反相微乳液体系；在氨水为催化剂的情况 下水解正硅酸乙酯制备小粒径二氧化硅纳米粒子；B、大粒径的二氧化硅纳米粒子可用st6ber法在乙醇/水溶液中用氨水催化TEOS 合成；C、将二氧化硅纳米粒子用硅烷偶联剂进行氨基化改性；得氨基化二氧化硅纳米粒 子；(2)将氨基化二氧化硅纳米粒子与抗体在缩合剂的作用下37°C孵育l-10h，高速 离心1-4次除去未结合抗体与缩合剂；(3)将离心后的沉淀物复溶，加入缩合剂及羧基化水溶性量子点，37°C下孵育 1-I0h，高速离心除去游离的量子点与缩合剂；制得二氧化硅/量子点复合微球探针，用稀 释液复溶，放入冰箱4°c条件下保存备用；(4)将划有二抗与包被抗原或相应抗体的硝酸纤维素膜、吸水垫、喷有量子点微球 探针的玻璃纤维素膜、玻纤膜或聚酯膜样品垫组装在背板上，组建免疫层析试纸条体系；(5)对于检测灵敏度要求高的检测物，增加量子点微球探针与样品的孵育步骤，增 加反应时间移取量子点微球探针于可拆卸96孔板小孔中，冷冻干燥或低温真空干燥后密 闭保存，在检测时滴加样品处理液于小孔中进行复溶，静置反应2-10分钟；吸取；加入没有 结合垫的免疫层析试纸条中检测；(6)可半定量与定量检测A、半定量检测滴加样品后于紫外灯下观测条带显色情况；B、定量检测制作具有激发光源、信号采集、光信号数字转换部件与软件的定量检 测平台。步骤(1)制备氨基化二氧化硅纳米粒子A与C两个步骤结合的方法也可另选用一 步法二氧化硅纳米粒子在反相微乳液中制备结束以后，直接在体系中加入氨基化硅烷 偶联剂氨基化修饰。步骤(2)所述缩合剂为1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N-羟基琥珀酰 亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺的一种或几种混合。步骤(3)所述量子点是水溶性表面具有羧基的量子点或核壳结构量子点的一种； 可以直接在水相中合成，或者油相合成后进行水相改性。步骤(3)所述稀释液为含牛血清白蛋白、蔗糖、叠氮钠、聚乙二醇20000、吐温-20 等物质的缓冲溶液。量子点微球探针可喷在玻璃纤维素膜上作为结合垫组装在试剂条上；直接移取一 定量探针于96孔板小孔中，干燥密封保存，检测时用样品或样品处理液复溶并孵育。检测物质为大分子物质时，采 用双抗体夹心法等，检测线的组成物为检测物的另一抗体；检测物质为小分子物质时，采用 竞争法，检测线的组成物为检测物的包被抗原。免疫层析试纸条检测线为1条_3条；多残留检测，每种残留物对应抗体分别用不 同荧光颜色的量子点微球进行标记。本专利技术的要点是应用氨基化二氧化硅纳米粒子为核心，先用少量偶联剂偶联将 抗体共价连接于其上，然后在离心纯化以后，将大量羧基化量子点共价偶联于氨基化二氧 化硅纳米粒子表面以及已与二氧化硅纳米粒子结合的抗体之上，在一个微球上附着有大量 的量子点，极大的提高了量子点微球探针的荧光强度，从而极大的提高了免疫层析的灵敏 度。此外，为了得到灵敏度更高的产品，改进了免疫层析方法，灵敏度得到进一步的提升。本 专利技术可用于疾病诊断、环境监测、毒品检测、违禁药品检测、食品安全分析等方面的单残留 或多残留快速、高灵敏度半定量检测，配备一些其他设备还可实现定量检测。具体检测方法包括以下几个步骤(1)在表面活性剂，油相，水相，助剂组成的反相微乳液体系中，用氨水水解正硅酸 乙酯(TEOS)制备二氧化硅纳米粒子，此二氧化硅纳米粒子粒径为10-200nm。制备更大粒 径的均一二氧化硅纳米粒子可用s tSber专利技术的s tsber法，在乙醇/水溶液中用氨水催化 TEOS得到200-1000nm的二氧化硅纳米粒子。(2)然后将二氧化硅纳米粒子用硅烷偶联剂3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、 3-(2_氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷(AEAPS)，或结合本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种超灵敏量子点微球免疫层析试纸条快速检测方法，包括以下步骤：（１）制备氨基化二氧化硅纳米粒子：Ａ、由表面活性剂、油相、水相、助剂配制反相微乳液体系；在氨水为催化剂的情况下水解正硅酸乙酯制备小粒径二氧化硅纳米粒子；Ｂ、大粒径的二氧化硅纳米粒子可用Ｓｔ＊ｂｅｒ法在乙醇／水溶液中用氨水催化ＴＥＯＳ合成；Ｃ、将二氧化硅纳米粒子用硅烷偶联剂进行氨基化改性；得氨基化二氧化硅纳米粒子；（２）将氨基化二氧化硅纳米粒子与抗体在缩合剂的作用下３７℃孵育１－１０ｈ，高速离心１－４次除去未结合抗体与缩合剂；（３）将离心后的沉淀物复溶，加入缩合剂及羧基化水溶性量子点，３７℃下孵育１－１０ｈ，高速离心除去游离的量子点与缩合剂；制得二氧化硅／量子点复合微球探针，用稀释液复溶，放入冰箱４℃条件下保存备用；（４）将划有二抗与包被抗原的硝酸纤维素膜、吸水垫、喷有量子点微球探针的玻璃纤维素膜、玻纤膜或聚酯膜样品垫组装在背板上，组建免疫层析试纸条体系；（５）对于检测灵敏度要求高的检测物，增加量子点微球探针与样品的孵育步骤，增加反应时间：移取量子点微球探针于９６孔板小孔中，冷冻干燥或低温真空干燥后密闭保存，在检测时滴加样品处理液于小孔中进行复溶，静置反应２－１０分钟；吸取；加入没有结合垫的免疫层析试纸条中检测；（６）半定量与定量检测：Ａ、半定量检测：滴加样品后于紫外灯下观测条带显色情况；Ｂ、定量检测：制作具有激发光源、信号采集、光信号数字转换部件与软件的定量检测平台。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王元凤，白亚龙，魏新林，
申请(专利权)人：上海师范大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]