【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分析化学检测，具体涉及一种便携式纸基病毒分子印迹荧光传感器的制备方法。
技术介绍
1、科学家们发了多种卓有成效的病毒检测方法。例如，细胞培养、石英晶体微量天平(qcm)、聚合酶链反应(pcr)、酶联免疫吸附测定(elisa)等方法已常规使用。然而，这些方法往往需要昂贵的抗体和酶用作识别元件，需要使用昂贵的专业仪器设备，耗时长且需要训练有素的专业人员操作，不利于病毒的快速检测。因此，迫切需要开发快速、准确、灵敏、便携和易于操作的检测技术，甚至开发待检人员自助式快速检测方法。
2、分子印迹过程可以定义为人工定制与模板分子大小、形状和官能团特异性匹配或识别的结合位点。通过添加模板、聚合功能单体，交联剂和引发剂引发聚合，然后，采用合适的洗脱剂洗脱去除模板，产生与目标物特异性识别空腔，得到分子印迹聚合物(mips)。近年来，已经发展了较多应用于病毒检测的分子印迹技术。例如，tancharoen等人构建了一种基于表面印迹的血清寨卡病毒检测电化学生物传感器。卢等人构建了用于检测hiv相关蛋白的表位印迹亲水聚合物包被的qcm，其检测限为2ng/ml(512pm)。罗等人构建了基于多功能分子印迹荧光传感器，可实现甲型和乙型肝炎病毒可视化同时检测，检测限分别为3.4和5.3pm。唐等人构建了一种基于“爆炸式”二次放大策略的超灵敏病毒可视化检测分子印迹病毒传感器，荧光和比色检测的检测限分别可达8.33fm和2.08pm，然而这些方法虽然取得了较好的检测，但存在无法可视化或成本高或无法便携式等缺点。
3、纸张具有廉
4、金属有机骨架(mofs)是金属(单金属离子、金属团簇或金属链)和有机接头在温和条件下自组装形成的新生杂化无机-有机材料家族。mofs具有结构多样性、大表面积、可以调节的孔径和功能等。较大的表面积和孔径可作为潜在的药物载体，可封装多种类型的药物。沸石咪唑酸盐骨架(zif)是mofs材料中应用最为广泛的子类之一。
5、为了构建低成本、便携式、肉眼可视化的病毒分子印迹传感器，本专利技术以价廉易得、大表面积、易裁剪、易修饰的纸张为基底，在其表面进行印迹后得到分子印迹聚合物(mips)。另一方面，合成了包覆罗丹明(rhb)的zif-8-nh2材料以用作荧光比色探针(zif-8-nh2@rhb～apt)。结果表明，该传感器不仅可以通过可见光、紫外灯对目标病毒进行肉眼可视化半定量分析，还可通过荧光光谱进行高灵敏的定量检测。另外，该传感器还具有低成本、便携、高灵敏、高特异性等优点。
技术实现思路
1、针对现有方法成本较高、仪器复杂等不足，本专利技术的目的是构建了一种便携式纸基病毒分子印迹荧光传感器的制备方法，并将所述传感器用于病毒的特异性、可视化检测。
2、一种便携式纸基病毒分子印迹荧光传感器的制备方法，其特征在于，该方法具有以下工艺步骤：
3、(1)以便携式、价廉易得的纸张(wp)作为基底，以流感病毒h5n1为模板病毒，3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)为功能单体，硅酸四乙酯(teos)为交联剂，氨水(nh3·h2o)为催化剂，通过溶胶-凝胶工艺制备了分子印迹聚合物，采用洗脱剂洗脱模板h5n1后得到与模板病毒具有形状、大小相同的识别腔的纸基分子印迹聚合物(mips)，将其作为模板病毒的捕获与分离元件；
4、(2)将染料罗丹明b(rhb)包覆在zif-8-nh2内部，在其表面通过酰胺键共价连接h5n1的适配体(h5n1～apt)，形成荧光比色纳米探针(zif-8-nh2@rhb～apt)，作为纸基上的荧光比色信号输出元件；
5、(3)mips通过形状、大小、功能单体之间的氢键作用协同识别流感病毒h5n1，同时h5n1与zif-8-nh2@rhb～apt通过特异性的适配体结合，三者形成三明治状的夹心结构。三者结合后，将上清液去除，未结合的zif-8-nh2@rhb～apt留在上清液中，纸基mips上含有一定量的与流感病毒h5n1结合的zif-8-nh2@rhb～apt，因此zif-8-nh2@rhb～apt随着流感病毒h5n1浓度的增加而增加，相应的荧光信号越强，可视化颜色越深；
6、(4)便携式纸基病毒传感器的制备及应用：将模板病毒h5n1与纸基分子印迹聚合物在优化的实验条件下吸附一段时间后，再加入荧光比色探针zif-8-nh2@rhb～apt吸附一段时间，干燥，将该纸基复合物沿比色皿对角线放置于比色皿中，在激发波长为365nm，发射波长为590nm，狭缝为5.0nm-5.0nm，电压700v下，采用f-4600荧光分光光度计测其荧光强度，构建一种便携式纸基病毒分子印迹荧光传感器。
7、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
8、(1)以纸张作为病毒分子印迹的载体材料。纸张具有廉价易得，亲水性优良、易裁剪、易修饰、易展示、易存储、无毒、便于携带等优点，为流感病毒h5n1提供灵敏可靠的检测方法，降低了传感器的制备成本，使传感器小型、便携化，可实现待检者的可视化自助检测；
9、(2)以zif-8-nh2包覆罗丹明b(rhb)，zif-8-nh2具有大表面积和大孔径，能够包覆更多的rhb，能够产生更明显的输出信号；同时rhb在肉眼及紫外灯下均有明显的颜色，能够实现肉眼和紫外辐照下的可视化检测；
10、(3)适配体(h5n1～apt)可与流感病毒h5n1高特异性的识别与结合，能够显著增加传感器的特异性，提高灵敏度；
11、(4)结果表明，便携式纸基传感器具有高特异性和令人满意的灵敏度，同时具备便携式与可视化的能力；
12、(5)所述传感器具有应用于其它分子检测的潜在可能性，且检测过程对操作人员的专业要求不高，具有重要的实际应用价值。
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1.一种便携式纸基病毒分子印迹荧光传感器的制备方法，以价廉易得的纸张为载体材料，以流感病毒H5N1为模板分子，采用溶胶-凝胶工艺制备分子印迹聚合物，使用荧光比色纳米探针(ZIF-8-NH2@RhB～Apt)作为纸基上的荧光比色信号输出元件，具体包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的便携式纸基病毒分子印迹荧光传感器的制备方法，其特征在于：步骤4)荧光检测条件为：激发波长：365nm，发射波长：590nm，激发狭缝：均为5nm，发射狭缝：5nm。
3.根据权利要求1所述的便携式纸基病毒分子印迹荧光传感器的制备方法所制备的便携式纸基病毒分子印迹荧光传感器的应用，其特征在于：取特定浓度的H5N1和MIPs/NIPs于pH＝7.4的PBS缓冲液，在37℃下振荡吸附1h后，去除上清液，并用PBS洗涤3次，再重新加入pH＝7.4的PBS缓冲液和150μL(2mg/mL)的ZIF-8-NH2@RhB～Apt，37℃下继续孵育40min，测其纸基的荧光强度并拍摄可见光下和紫外灯下纸基MIPs/NIPs上的颜色。
【技术特征摘要】
1.一种便携式纸基病毒分子印迹荧光传感器的制备方法，以价廉易得的纸张为载体材料，以流感病毒h5n1为模板分子，采用溶胶-凝胶工艺制备分子印迹聚合物，使用荧光比色纳米探针(zif-8-nh2@rhb～apt)作为纸基上的荧光比色信号输出元件，具体包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的便携式纸基病毒分子印迹荧光传感器的制备方法，其特征在于：步骤4)荧光检测条件为：激发波长：365nm，发射波长：590nm，激发狭缝：均为5nm，发射狭缝：5nm。
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