本发明专利技术涉及农药甲基毒死蜱的快速检测器具。一种甲基毒死蜱残留分析的快速检测试纸条。试纸条含有衬板（１）、样品垫（２）、金标结合垫（３）、纤维素膜（４）和吸水垫（７），金标结合垫为吸附甲基毒死蜱金标抗体的玻璃纤维棉，在纤维素膜上有用甲基毒死蜱半抗原偶联的载体蛋白溶液印制的直线式隐形检测线，用兔抗鼠ＩｇＧ印制的直线式隐形对照线，两条线平行排列组合。本发明专利技术试纸条具有特异性强，检测灵敏度高、快速、简便、直观、准确的特点，并且前处理简单，不需要任何仪器设备，无需专业人员操作。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及农药残留免疫分析
的一种快速检测器具，特别是涉及以纳米 胶体金颗粒标记抗体的甲基毒死蜱胶体金快速检测试纸条。
技术介绍
甲基毒死蜱(Chlorpyrifos-methyl)是一种广谱的有机磷杀虫剂，用于防治贮藏 谷物中的害虫和各种叶类作物上的害虫，也用来防治蚊成虫、蝇类、水生幼虫和卫生害虫， 目前仍在广泛应用。其作用机理是抑制乙酰胆碱酯酶的活性。乙酰胆碱是神经递质，过量 的乙酰胆碱过度刺激乙酰胆碱受体，导致靶生物死亡。然而，一些不是预定目标的生物也遭 到了毒害，包括人、鱼等其他生物。目前，对农药残留的检测方法主要是仪器分析方法和酶联免疫分析方法(ELISA) 等。仪器分析方法包括高效液相色谱法(High performance liquid chromatography, HPLC)、气相色谱法(Gas chromatography, GC)、薄层色谱法(Thin layer chromatography, TLC)、液-质串联法(HPLC-MS)和气-质串联法(GC-MS)等，这些仪器分析方法虽然可以达 到较高的检测灵敏度，但需要复杂昂贵的仪器设备及专业操作人员，加之样品前处理繁琐 费时、检测费用高，难以满足快速、在线检测的需要。ELISA方法，法所需要的检测时间较长， 操作过程仍较复杂，检测成本较高，而且只能在室内进行检测等缺陷。因而ELISA方法的应 用受到很大的限制。本专利技术的甲基毒死蜱胶体金试纸条，无需专业操作人员及任何辅助类仪器，根据 反应所显现的条带几分钟内即可判定结果，不仅操作简便、快速、结果直观准确、成本低，并 且可以在室外进行检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服上述甲基毒死蜱检测技术的不足，研制出一种特异、敏感、 快速、简便的甲基毒死蜱残留快速检测试纸条。本专利技术的技术方案是一种甲基毒死蜱快速检测试纸条，含有衬板和在衬板上一 次衔接的样品垫、金标结合垫、纤维素膜、和吸水垫，金标结合垫为吸附甲基毒死蜱金标抗 体的玻璃纤维棉，在纤维素膜上有用甲基毒死蜱半抗原偶联的载体蛋白溶液印制的直线式 隐形检测线，用兔抗鼠IgG印制的直线式隐形对照线，两条线平行组合排列为“ 11 ”。所述的衬板为不吸水的韧性材料。所述的韧性材料用硬质塑胶条或不吸水硬纸条制成。所述的样品垫为玻璃纤维棉，或尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜和聚酯膜。所述的样品垫用玻璃纤维棉制成。所述的吸水垫为吸水能力较强的吸水滤纸或滤油纸。所述的纤维素膜为硝酸纤维素膜，或为纯纤维素膜，或为羧化纤维素膜。所述的保护膜为不透明的胶膜，样品垫、金标结合垫对应的保护膜上印制有待测样品标记线，该标记线偏向样品垫一侧约0. 5厘米处。所述的甲基毒死蜱金标抗体为胶体金标记的甲基毒死蜱单克隆抗体，所述的偶联 甲基毒死蜱半抗原的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA，或为鸡卵清白蛋白0VA，或为人血清白 蛋白HAS。 本专利技术的快速检测试纸条具有以下优点1.特异性强，敏感性高。本胶体金试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为 基础制备而成，金标抗体中的胶体金颗粒与抗体分子之间无共价键，两者通过异性电荷间 的范德华力相结合，胶体金的标记对单克隆抗体的特异性和亲和力影响很小，而且有较高 的标记率。因此，试纸条很好的保留了单克隆抗体的特性，具有较强的特异性和较高的敏感 性，检出最低限量可达到600ppb。2.简便、快速。在使用本胶体金试纸条时，无需任何其他辅助仪器，可现场操作，只 要将检测样加入样品垫，在10分钟内即可判定检测结果。3.结果显示形象、直观、准确。胶体金试纸条的检测结果以纤维素膜上的显色情况 来判断。如果样品中有待测物时，待测物和金标抗体结合形成抗原一金标抗体复合物，并且 继续上移，遇T线不显色或者显色很弱即表示检测样品阳性或者弱阳性；如果样品中没有 待测样品时，金标抗体继续上移，遇T线显示一条清晰红线即表示检测样品阴性。C线颜色 的有或无表示此试纸条的有效或无效。结果判定形象、直观、准确、简单明了。4.节省费用，适用范围广，便于推广。使用胶体金试纸条进行检测，比使用仪器和 ELISA试剂盒检测进行检测的费用大幅降低。再者，试纸条的使用范围广，可满足不同层次 人员的需要，便于推广应用，具有广阔的市场前景和明显的经济和社会效益。四附图说明图1、甲基毒死蜱快速检测试纸条俯瞰结构示意图。图2、甲基毒死蜱快速检测试纸条剖面结构示意图。图中，1 衬板，2 样品垫，3 金标物结合垫，4 纤维素膜，5 检测线，6 对照线，7 吸水垫，8-1 样品浸入端保护膜，8-2 手柄端保护膜，9 标识线。图3、甲基毒死蜱快速检测试纸条结果判定示意中，A为阴性样品检测结果，B为弱阳性样品检测结果，C为强阳性样品检测结 果，D和E为试纸条失效。五具体实施例方式要制备甲基毒死蜱快速检测试纸条，首先要制备偶联甲基毒死蜱半抗原的载体蛋 白，用于印制检测线，进而制备甲基毒死蜱的金标抗体，用于制备金标抗体纤维棉，其次需 要制备兔抗鼠IgG抗体，用于制备对照线。下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。实施例一(制备实施例)1.甲基毒死蜱半抗原(0-甲基-0-(3，5，6三氯吡啶基)-N-(丁酸)硫代磷酸酯) 的合成①0-甲基-0-(3，5，6三氯吡啶基)硫代磷酰氯的合成。称取3，5，6_三氯_2_ 口比 啶醇4. 21g(约21. Immol)用乙腈溶解；常温下，将溶液逐滴加入20mL乙腈溶解的0-甲基硫代磷酰氯3. 83g(约23. 2mmol)、粉状K2CO3 8. 7g(约63mmol)混合溶液，滴完后，继续反 应1小时。反应完毕后真空过滤，蒸去溶剂，得黄色油状物。柱层析，用石油醚/ 二氯甲烷 (8 1，体积比)洗涤，蒸去溶剂得淡黄色油状液体6.88g(产率为72.6%)。②0-甲基-0-(3，5，6三氯吡啶基)-N_(丁酸)硫代磷酸酯的合成。称取4_氨 基丁酸0. 54g(约5. 2mmol)、KOH 0. 78g(约11. 4mmol)，溶解于6mL甲醇中，冰水浴冷却至 0-10°C，搅拌下缓慢加入溶解于6mL甲醇溶液的(1) 1. 38g(约4. 2mmol)，保温反应2小时。 反应完毕后，用石油醚/乙醚(7 1，体积比)洗涤，水层调PH= 3.0后用乙醚提取，无水 硫酸钠干燥，蒸去溶剂，得浅黄色油状物0-甲基-0-(3，5，6三氯吡啶基)-N-(丁酸)硫代 磷酸酯1.28g(产率为78%)。2.甲基毒死蜱半抗原与载体蛋白偶联利用活泼酯法(Active Ester method，简称AE法)将具有羧基末端(-C00H)的半 抗原偶联到大分子的蛋白质上。分别称取0. Immol半抗原与0. Immol NHS，用600μ1 DMF溶 解于反应装置中；称取0. Immol 00，用40(^1 DMF溶解；将DCC/DMF溶液缓慢滴加到上述 反应装置中。在磁力搅拌下室温密封反应7小时。反应终液置4°C冰箱冷却2小时以上，经 SOOOrpm离心5分钟，取上清活泼酯液十分缓慢的加入到5ml 15mg/ml的BSA蛋白中，反应 在磁力搅拌下室温搅拌4小时。待反应完成后，将反应液置于透析袋内，于0. 02mol/LpH6. 8 的PB缓冲液中4°C搅拌透析，每四小时换一次透析液本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种甲基毒死蜱残留分析的快速检测试纸条，含有衬板和在衬板上一次衔接的样品垫、金标结合垫、纤维素膜、和吸水垫，在试纸条两端粘贴有保护膜，其特征是：金标结合垫为吸附甲基毒死蜱金标抗体的玻璃纤维棉，在纤维素膜上有用甲基毒死蜱半抗原偶联的载体蛋白溶液印制的直线式隐形检测线，用兔抗鼠ＩｇＧ印制的直线式隐形对照线，两条线平行组合排列为“｜｜”。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘凤权，华修德，钱国良，秦娜，李刚，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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