【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学，具体涉及一种tyrp1基因编辑“大花”瓯江彩鲤的制备方法。
技术介绍
1、鲤(cyprinuscarpio)是全世界分布最为广泛的淡水鱼类之一，是全球的重要养殖对象。瓯江彩鲤(c.carpio var.color)是鲤的一种体色变异群体，原分布于我国浙江省瓯江流域，因其优美的体色以及上佳的口感而成为一种重要的经济鱼类。相比斑马鱼，瓯江彩鲤的体色更加丰富多样，由黑色、白色、红色组合形成多种体色类型，同时由于鲤特殊的四倍化基因组现象，功能基因的加倍十分常见，使瓯江彩鲤成为研究鱼类体色基因的功能与进化的理想模型。利用基因编辑技术，制备体色基因缺陷型瓯江彩鲤模型，将为鱼类体色遗传研究提供重要的材料。然而，由于瓯江彩鲤的体色相关基因大多存在两个及以上拷贝，获得功能缺陷突变体需要同时对多个同效基因进行编辑，难度较大，瓯江彩鲤的受精卵粘性大，为显微注射带来困难，此外瓯江彩鲤的性成熟期为二至三年，使用传统的多代杂交获得纯合突变体耗时过长，因此在瓯江彩鲤中建立多拷贝体色相关基因同时敲除技术，并在原代获得高度突变模型，缩短获得纯合突变体的时间，对鱼类体色相关基因的进化研究意义重大。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于设计提供一种tyrp1基因编辑“大花”瓯江彩鲤的制备方法的技术方案。本专利技术应用crispr/cas9基因编辑技术，敲除“大花”瓯江彩鲤的三个tyrp1基因，制备了tyrp1基因缺陷型的棕色版块瓯江彩鲤突变体。
2、本专利
3、本专利技术提供了一种tyrp1基因编辑“大花”瓯江彩鲤的制备方法，其包括如下步骤：
4、(1)亲鱼的筛选
5、剪取瓯江彩鲤备选亲鱼部分鳍条，使用苯酚氯仿抽提法提取基因组dna，使用引物进行pcr扩增检测三个tyrp1基因序列，将pcr产物进行sanger测序，逐个查看测序结果的峰图，将靶点处无碱基突变，并且峰图均为单峰的亲本挑出，雌雄分开养殖，作为注射用受精卵的亲鱼；
6、(2)sgrna模板合成与体外转录
7、合成sgrna转录模板引物，tyrp1a基因靶点1的上游引物如seq id no.7所示，tyrp1a基因靶点2的上游引物如seq id no.8所示，tyrp1a基因靶点3的上游引物如seq idno.9所示，tyrp1b基因靶点1的上游引物如seq id no.10所示，tyrp1b基因靶点2的上游引物如seq id no.11所示，tyrp1c基因靶点1的上游引物如seq id no.12所示，tyrp1c靶点2的上游引物如seq id no.13所示，下游引物均如seq id no.14所示；
8、将引物干粉稀释后进行pcr，产物经过琼脂糖凝胶检测后确认为单带，大小在100bp稍上，使用axygen pcr clean试剂盒回收，作为体外转录模板，使用promega p1300t7体外转录试剂盒进行体外转录，最终共获得七条sgrna；
9、(3)瓯江彩鲤人工授精与布板
10、取雄鱼精子和雌鱼卵子充分混匀进行人工授精，挑取优质受精卵用于显微注射；
11、(4)显微注射
12、将neb nls-cas9-nls蛋白与七条sgrna溶液混合，使cas9蛋白终浓度为800ng/ul，sgrna终浓度为250ng/ul，将混合液注射至受精卵中，注射量占卵面积的十分之一；显微注射过程中，将室温和孵化水温控制在16℃，延缓受精卵发育；在受精卵吸水膨胀期开始注射，一直到一细胞末期结束注射；
13、幼鱼孵化后转到室外池塘进行养殖，待体色稳定后取dna样品检测突变效率，即可得到tyrp1基因缺陷型“大花”瓯江彩鲤。
14、进一步，所述步骤(1)中检测tyrp1a基因的上游引物tya ex1ex2 f如seq id no.1所示，下游引物tya ex1ex2 r如seq id no.2所示，检测tyrp1b基因的上游引物tyb ex1ex2f如seq id no.3所示，下游引物tyb ex1ex2 r如seq id no.4所示，检测tyrp1c基因的上游引物tyc ex1ex2 f如seq id no.5所示，下游引物tyc ex1ex2 r如seq id no.6所示。
15、进一步，所述步骤(1)中pcr反应体系为：primestar max premix(2x)*25μl，模板dna 1μl，10μmol引物各1μl，dd水22μl；扩增条件为：94℃3min，94℃30s、58.5℃30s、72℃2min，35个循环，72℃10min，4℃结束。
16、进一步，所述步骤(2)中pcr体系为：上游引物1.5ul，下游引物1.5ul，high-fidelity 2x pcr master mix 10ul，depc水7ul；扩增条件为：94℃预变性3min后进入24次循环：94℃30s、65℃30s，72℃1min；最后72℃延伸5min，4℃结束。
17、进一步，所述步骤(3)中瓯江彩鲤人工授精与布板具体为：
18、轻压雄鱼腹部，使用干燥塑料吸管收集精液置于离心管中，避光保存于4℃冰箱，连续使用五天；按照每公斤鱼体重25ug和每公斤鱼体重1000～1200iu的剂量将促黄体素释放激素a2和绒毛膜促性腺激素hcg混合物注射至雌鱼胸鳍基部，待雌鱼开始产卵，用干燥洁净的毛巾擦净鱼体生殖孔部位，轻压鱼体腹部，用无水无油的容器收集卵子，使用干毛巾覆盖并包裹避光保存于4℃冰箱；
19、将玻璃培养皿放在30cm深水桶底部，将水桶装满饮用水，将水温调至16℃，使用光滑无水的羹匙舀出100g卵子放在干净的玻璃皿中，吸取0.5ml精液与卵子充分混匀，将玻璃皿放在水桶表层水体中，迅速将玻璃皿中的卵均匀抖落，使卵子一边受精一边沉落并粘附在桶底的培养皿上，取出培养皿，清水冲洗，留少量水于培养皿中，漫过受精卵即可，于体式显微镜下观察，健康的受精卵吸水膨胀过程中颜色由黄色逐渐变为透明，未受精卵形状不规则，卵内容物浑浊，挑落未受精卵，优质受精卵用于显微注射。
20、进一步，所述步骤(4)中注射针涂抹少量矿物油，避免受精卵黏性卵膜黏着。
21、进一步，所述步骤(4)中使用亚甲基蓝溶液浸泡注射后的受精卵六小时，预防感染发霉。
22、本专利技术应用crispr/cas9基因编辑技术，敲除“大花”瓯江彩鲤的三个tyrp1基因，制备了tyrp1基因缺陷型的棕色版块瓯江彩鲤突变体，本专利技术通过本专利技术限定的方法在原代获得高度突变模型，缩短获得纯合突变体的时间，对鱼类体色相关基因的进化研究意义重大。
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1.一种TYRP1基因编辑“大花”瓯江彩鲤的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的一种TYRP1基因编辑“大花”瓯江彩鲤的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中检测TYRP1a基因的上游引物Tya ex1ex2 F如SEQ ID NO.1所示，下游引物Tyaex1ex2 R如SEQ ID NO.2所示，检测TYRP1b基因的上游引物Tyb ex1ex2 F如SEQ ID NO.3所示，下游引物Tyb ex1ex2 R序列如SEQ ID NO.4所示，检测TYRP1c基因的上游引物Tycex1ex2 F如SEQ ID NO.5所示，下游引物Tyc ex1ex2 R如SEQ ID NO.6所示。
3.如权利要求1所述的一种TYRP1基因编辑“大花”瓯江彩鲤的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中PCR反应体系为：PrimeSTAR Max Premix(2X)*25μL，模板DNA 1μL，10μmol引物各1μL，dd水22μL；扩增条件为：94℃ 3min，94℃ 30s、58.5℃ 30s、72℃ 2min，35个循环，72℃ 10min
4.如权利要求1所述的一种TYRP1基因编辑“大花”瓯江彩鲤的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中PCR体系为：上游引物1.5uL，下游引物1.5uL，High-Fidelity 2XPCR Master Mix 10uL，DEPC水7uL；扩增条件为：94℃预变性3min后进入24次循环：94℃30s、65℃ 30s，72℃ 1min；最后72℃延伸5min，4℃结束。
5.如权利要求1所述的一种TYRP1基因编辑“大花”瓯江彩鲤的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中瓯江彩鲤人工授精与布板具体为：
6.如权利要求1所述的一种TYRP1基因编辑“大花”瓯江彩鲤的制备方法，其特征在于所述步骤(4)中注射针涂抹少量矿物油，避免受精卵黏性卵膜黏着。
7.如权利要求1所述的一种TYRP1基因编辑“大花”瓯江彩鲤的制备方法，其特征在于所述步骤(4)中使用亚甲基蓝溶液浸泡注射后的受精卵六小时，预防感染发霉。
...【技术特征摘要】
1.一种tyrp1基因编辑“大花”瓯江彩鲤的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的一种tyrp1基因编辑“大花”瓯江彩鲤的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中检测tyrp1a基因的上游引物tya ex1ex2 f如seq id no.1所示，下游引物tyaex1ex2 r如seq id no.2所示，检测tyrp1b基因的上游引物tyb ex1ex2 f如seq id no.3所示，下游引物tyb ex1ex2 r序列如seq id no.4所示，检测tyrp1c基因的上游引物tycex1ex2 f如seq id no.5所示，下游引物tyc ex1ex2 r如seq id no.6所示。
3.如权利要求1所述的一种tyrp1基因编辑“大花”瓯江彩鲤的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中pcr反应体系为：primestar max premix(2x)*25μl，模板dna 1μl，10μmol引物各1μl，dd水22μl；扩增条件为：94℃ 3min，94℃ 30s、58....
【专利技术属性】
技术研发人员：陈红林，陈晓雯，王军，王成辉，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：
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