【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种利用细胞色素p450酶重组菌合成雌三醇化合物的方法，具体来说，是通过利用新型细胞色素p450酶cyp154c34与还原伴侣rhfred的共表达的重组菌进行生物转化获得雌三醇化合物的方法。
技术介绍
1、细胞色素p450酶作为生物催化剂，能够在温和条件下催化化合物中未活化的碳氢键，并且具有严格的局域选择性和立体选择性。其在环境污染物降解、精细化学品合成以及药物的合成生物学领域具有巨大的应用潜力。随着dna测序技术的大力发展，大量的微生物基因组数据信息的积累，挖掘新的具有工业应用价值的p450酶日渐成为关注的热点。已有如青篙酸，普伐他汀等药物中间体及药物通过p450酶催化合成的工业化成功案例使得人们对p450酶能催化更多类型的药物工业合成更具信心。
2、甾体类药物是目前使用的仅次于抗生素的第二大类药物，大多数甾体类药物是利用对天然甾体化合物的结构修饰获得的具有新颖的生物活性的化合物。雌二醇经过修饰后可获得雌三醇药物。雌三醇的雌激素活性较小，口服活性约为雌酮的6倍，无致癌作用，服药后体内雌二醇水平不发生变化。雌三醇对阴道和子宫颈管具有选择作用，而对子宫实体及子宫内膜并无影响。动物实验表明，雌三醇对阴道上皮角化作用比雌二醇强，能促进阴道上皮增生，表层细胞角化，黏膜血管新生和阴道上皮损伤愈合，但对小鼠子宫增重作用较弱；同时雌三醇能增强子宫颈细胞功能，使子宫颈肌纤维增生，增加宫颈弹性和柔软性。此外，雌三醇对下丘脑和垂体有反馈性抑制作用，但不抑制排卵，仅对黄体能产生明显影响，因此可用作中期引产及人工流产
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于公开了一种利用细胞色素p450酶重组菌合成雌三醇化合物的方法。
2、本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：
3、一种细胞色素p450酶，其编码基因为cyp154c34基因，cyp154c34基因序列如seqid no.3所示。
4、一种细胞色素p450酶重组菌，所述重组菌包括细胞色素p450酶的编码基因、rhfred基因和宿主细胞，所述细胞色素p450酶的编码基因为cyp154c34基因，cyp154c34基因序列如seq id no.3所示，rhfred基因序列如seq id no.4所示。
5、一种利用细胞色素p450酶重组菌合成雌三醇化合物的方法，具体为：
6、利用细胞色素p450酶重组菌的发酵液对底物雌二醇进行生物转化获得雌三醇。
7、进一步地，所述共表达cyp154c34基因和rhfred基因的细胞色素p450酶重组菌发酵液通过如下方法制备获得：
8、利用无缝克隆技术将pet28a载体与cyp154c34基因和rhfred基因连在一起，得到重组质粒pet28a-cyp154c34-rhfred，将所述质粒转入到大肠杆菌bl21(de3)，构建重组大肠杆菌即细胞色素p450酶重组菌，所述细胞色素p450酶重组菌共表达cyp154c34基因和rhfred基因；经筛选、前培养和扩大培养得到共表达cyp154c34基因和rhfred基因的菌体发酵液；所述pet28a的基因序列如seq id no.1所示，pet28a-cyp154c34-rhfred基因序列如seq id no.2所示，其中cyp154c34基因序列如seq id no.3所示，rhfred基因序列如seq idno.4所示。
9、进一步地，利用共表达cyp154c34基因和rhfred基因的细胞色素p450酶重组菌的发酵液对底物雌二醇进行生物转化获得雌三醇的条件为：
10、将重组菌的发酵液离心重悬在缓冲液中，保持ph为7.4，加入雌二醇底物进行生物转化，在25℃振荡反应24h后，对发酵液进行提取、分离，得到雌三醇化合物；所述底物在缓冲液中的浓度为100μm。
11、进一步地，所述缓冲液a的配方为40mm磷酸氢二钾、10mm磷酸二氢钾和10vol％甘油。
12、进一步地，所述前培养和扩大培养具体为：
13、将构建的重组大肠杆菌加入lb培养基中，在37℃条件下培养16h，获得重组大肠杆菌的种子液；将所述种子液接种到terrific broth培养基中，所述种子液和terrificbroth培养基的体积比为1:100，在37℃，摇床转速180r/min的条件下进行扩大培养，直至菌液od600值达到0.8，然后加入iptg诱导菌体表达蛋白，同时将温度降低至22℃，继续培养20h，离心收集菌体。所述iptg在terrific broth培养基中的终浓度为0.1mm。
14、本专利技术的有益效果是：①本专利技术涉及的cyp154c34为未公开的新酶，其重组菌可转化雌二醇化合物产生雌三醇化合物，这些产物现阶段在工业上主要从化学合成方法获得；②cyp154c34酶对类固醇类化合物具有严格的区域选择性和立体选择性，生产唯一产物即雌三醇，可提高分离提取的效率；③本专利技术构建的催化体系可以在温和条件下选择性地进行氧化反应，相比于传统化学反应的复杂工艺流程，其在生物制药领域具有很大的应用价值；④利用重组菌的生物转化可大大减少副反应产物，易于分离出所要的产物，因此达到高效率。⑤本专利技术构建的催化体系对雌二醇催化生产雌三醇的转化率约为95％提高了原料和能源利用效率，具有巨大的市场前景。
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1.一种细胞色素P450酶，其特征在于，其编码基因为CYP154C34基因，CYP154C34基因序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种细胞色素P450酶重组菌，其特征在于，所述重组菌包括权利要求1所述细胞色素P450酶的编码基因、RhFRED基因和宿主细胞，所述细胞色素P450酶的编码基因为CYP154C34基因，CYP154C34基因序列如SEQ ID NO.3所示，RhFRED基因序列如SEQ ID NO.4所示。
3.一种利用细胞色素P450酶重组菌合成雌三醇化合物的方法，其特征在于，具体为：
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞色素P450酶重组菌的发酵液通过如下方法制备获得：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，利用细胞色素P450酶重组菌的发酵液对底物雌二醇进行生物转化获得雌三醇的条件为：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的配方为40mM磷酸氢二钾、10mM磷酸二氢钾和10vol％甘油。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述前培养和扩大培养
...【技术特征摘要】
1.一种细胞色素p450酶，其特征在于，其编码基因为cyp154c34基因，cyp154c34基因序列如seq id no.3所示。
2.一种细胞色素p450酶重组菌，其特征在于，所述重组菌包括权利要求1所述细胞色素p450酶的编码基因、rhfred基因和宿主细胞，所述细胞色素p450酶的编码基因为cyp154c34基因，cyp154c34基因序列如seq id no.3所示，rhfred基因序列如seq id no.4所示。
3.一种利用细胞色素p450酶重组菌合成雌三醇...
【专利技术属性】
技术研发人员：许莲花，高齐霖，林素素，杨建，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：
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