【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域，尤其是涉及一种基于去核黑色素瘤细胞的肿瘤疫苗及其制备方法与应用。
技术介绍
1、临床上对细胞疫苗、核酸疫苗、蛋白多肽疫苗和基因工程疫苗等肿瘤疫苗进行了广泛研究，肿瘤疫苗在癌症治疗中取得了巨大的成就，尤其是在实体瘤的临床前研究中引发广大关注的肿瘤全细胞疫苗。肿瘤全细胞疫苗是指将自身或异体肿瘤细胞经过物理因素、化学因素以及生物因素(病毒感染、基因转移等)的处理，改变或消除其致瘤性、保留其免疫原性的一类疫苗，其常与佐剂等联合应用。该细胞能够表达丰富的各类肿瘤抗原，无需抗原鉴定，不必考虑mhc个体差异，并且能同时激活cd8+t细胞和cd4+t辅助细胞，产生更强的整体抗肿瘤应答效应，同时又降低肿瘤逃逸发生的机率。
2、相关技术中，尽管肿瘤全细胞疫苗相对于其他疫苗具有诸多优势，但是肿瘤全细胞本身属于肿瘤细胞，自身具有较强的致瘤性，且会分泌一些可溶性因子抑制树状突细胞与t细胞的功能，此外还存在表达抗原的免疫原性较弱、不能诱导很强的特异性免疫反应等缺陷。因此存在一定的局限性。
3、基于此，本专利技术提出了一种基于去核黑色素瘤细胞的肿瘤疫苗旨在解决上述问题。
技术实现思路
1、本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出了一种基于去核黑色素瘤细胞的肿瘤疫苗，该肿瘤疫苗能够有效增强全细胞肿瘤疫苗的免疫原性，提高sting激动剂的生物利用度，募集并活化抗原呈递细胞，刺激巨噬细胞转化为m1型巨噬细胞，并且促进肿瘤内特异性t细胞
2、本专利技术还提出一种基于去核黑色素瘤细胞的肿瘤疫苗的制备方法。
3、本专利技术还提出一种基于去核黑色素瘤细胞的肿瘤疫苗在制备治疗和/或预防黑色素瘤产品中的应用。
4、本专利技术的第一方面，提供一种基于去核黑色素瘤细胞的肿瘤疫苗，所述肿瘤疫苗包括：
5、a1)去除细胞核的黑色素瘤细胞；以及，
6、a2)与所述去除细胞核的黑色素瘤细胞偶联的细菌外膜囊泡；
7、其中，所述细菌外膜囊泡中装载有sting激动剂。
8、根据本专利技术实施例的肿瘤疫苗，至少具有如下有益效果：
9、(1)本专利技术通过将装载有sting激动剂2’3’-cgamp的细菌外膜囊泡连接至去核的黑色素瘤细胞上，利用细菌外膜囊泡良好的免疫佐剂及生物相容性特性，增强了全细胞肿瘤疫苗的免疫原性，提高了sting激动剂的生物利用度，募集并活化了抗原呈递细胞，刺激巨噬细胞转化为m1型巨噬细胞，并且促进肿瘤内特异性t细胞的活化与增殖，最终达到抑制黑色素瘤生长的目的。
10、(2)与单用sting激动剂或者单用去核细胞相比，使用本专利技术设计的去核肿瘤细胞疫苗enucleated b16f10-bdvs-cgamp进行预免疫能在很大程度上保护健康小鼠免受黑色素瘤细胞的攻击，并有效增加cd44+cd62l-效应记忆型t细胞在肿瘤内的浸润，产生有效的抗癌功效与长期记忆免疫。
11、(3)本专利技术采用了去核黑色素瘤细胞，其相对于常规灭活处理的黑色素瘤细胞具有能维持细胞重要细胞器的基本功能，并且最大程度的保留肿瘤抗原，维持肿瘤细胞的免疫原性等优势。
12、在本专利技术的一些实施方式中，所述黑色素瘤细胞选自人黑色素瘤细胞或小鼠黑色素瘤细胞。
13、在本专利技术的一些实施方式中，所述人黑色素瘤细胞包括rpmi-7951、mewo、hs 688(a).t、colo829、c32、a-375、hs 294t、hs 695t、hs 852t、a2058细胞中的至少一种。
14、在本专利技术的一些实施方式中，所述小鼠黑色素瘤细胞包括b16f10-luc细胞。
15、在本专利技术的一些实施方式中，所述细菌外膜囊泡是由原核细胞制备得到。
16、在本专利技术的一些优选实施方式中，所述细菌外膜囊泡是由大肠杆菌制备得到。
17、在本专利技术的一些优选实施方式中，所述大肠杆菌为e.coli bl21(de3)plyss。
18、在本专利技术的一些实施方式中，所述大肠杆菌为重组e.coli bl21(de3)plyss。
19、在本专利技术的一些实施方式中，所述细菌外膜囊泡是通过大肠杆菌重组表达载体诱导表达、纯化得到。
20、细菌外膜囊泡(bacteria derived vesicles，以下简称bdvs)是包含多种磷脂、脂多糖、蛋白质等成分的膜性小泡，当bdvs含有的病原体相关模式分子(pathogenassociated molecular pattern，pamp)与宿主体内的树突状细胞膜表面模式识别受体(pattern recognition receptor，prr)接触后，将启动信号转导通路参与免疫调节，这些受体可以通过启动信号转导通路，改变细胞因子释放，增强共刺激分子(如cd40和cd80)的表达，同时在抗原呈递时增加dc对整合素(如cd11c)的黏附上调，激活先天免疫系统和获得性免疫系统。此外bdvs中的毒力因子可以传递给宿主细胞，刺激细菌-宿主细胞之间的相互作用，具有内在的抗肿瘤活性。
21、bdvs作为药物载体在肿瘤治疗方面有明显的优势：一方面，bdvs作为纳米级的囊泡，能够通过增强渗透和滞留效应维持其在肿瘤中的蓄积能力；另一方面，可以通过基因工程等手段对bdvs进行修饰，使其具有肿瘤特异的靶向性。此外，由于bdvs本身具有免疫原性，而其携带的肿瘤抗原进一步刺激了机体产生免疫反应，有助于弥补去核黑色素瘤细胞免疫原性不足问题，两者具有协同作用。
22、在本专利技术的一些实施方式中，所述重组表达载体表达lpp蛋白和ompa蛋白。
23、lpp是细菌外膜结构的主要成分之一，可以增强细菌对宿主免疫系统的逃避能力；ompa是一种外膜蛋白，参与细菌的黏附和入侵过程。
24、在本专利技术的一些实施方式中，所述重组表达载体表达lpp-ompa-gfp蛋白。
25、在本专利技术的一些实施方式中，所述lpp-ompa-gfp蛋白的编码核苷酸序列如seq idno.1所示。
26、在本专利技术的一些实施方式中，所述细菌外膜囊泡还含lpp蛋白和ompa蛋白。
27、在本专利技术的一些实施方式中，所述sting激动剂包括cgamp或cgamp衍生物。
28、环二核苷酸(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate，以下简称cgamp)作为一种常用的sting激动剂，能作为疫苗佐剂加强肿瘤疫苗的效果，抑制多种肿瘤细胞的生长，但由于其细胞膜通透性差，且毒性较大，大多数sting激动剂只能进行瘤内注射，而无法全身给药，很大程度上限制了sting的治疗效果。而本专利技术利用能够通过增强渗透和滞留效应维持其在肿瘤中的蓄积能力的细菌外膜囊泡为载体，有效提高了sting激动剂的利用效果。
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【技术保护点】
1.一种基于去核黑色素瘤细胞的肿瘤疫苗，其特征在于：所述肿瘤疫苗包括：
2.根据权利要求1所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述细菌外膜囊泡是通过大肠杆菌重组表达载体诱导表达、纯化得到。
3.根据权利要求1所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述STING激动剂包括cGAMP或cGAMP衍生物。
4.根据权利要求1所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述肿瘤疫苗还包括PD-1抗体。
5.一种如权利要求1至4任一项所述肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：S1中，制备所述去除细胞核的黑色素瘤细胞的方法包括密度梯度离心法。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：S2中，所述二苯并环辛炔偶联剂包括二苯并环辛炔-PEG4-N-羟基琥珀酰亚胺酯；
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：S3中，所述反应的温度为15～37℃；
9.如权利要求1至4任一项所述的基于去核黑色素瘤细胞的肿瘤疫苗在制备治疗和/或预防黑色素瘤产品中的应用。
10.
...【技术特征摘要】
1.一种基于去核黑色素瘤细胞的肿瘤疫苗，其特征在于：所述肿瘤疫苗包括：
2.根据权利要求1所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述细菌外膜囊泡是通过大肠杆菌重组表达载体诱导表达、纯化得到。
3.根据权利要求1所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述sting激动剂包括cgamp或cgamp衍生物。
4.根据权利要求1所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述肿瘤疫苗还包括pd-1抗体。
5.一种如权利要求1至4任一项所述肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的制备方法，...
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