【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物防治，更具体地说，它涉及一种安达曼链霉菌pl25及其在防治小麦赤霉病中的应用。
技术介绍
1、小麦是全球三大谷物之一，种植面积最为广泛，也是我国重要的经济粮和储藏粮，并在国民经济中起着重要作用。小麦赤霉病是由禾谷镰刀菌等多种镰刀菌属真菌侵染引起的小麦重要病害。近年来，由于气候和耕作制度变化，小麦赤霉病流行成灾，危害程度不断加深。小麦赤霉病除造成小麦减产外，还会产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮等多种镰刀菌毒素。人类和牲畜一旦误食了含有这些毒素的小麦，就会产生一系列的中毒反应，严重时甚至导致死亡。目前，使用有益微生物和拮抗菌对小麦赤霉病进行防治是一种高效兼环境友好型的生物防治方法，具有较大的应用潜力。
2、几丁质，俗称甲壳素，广泛存在于微生物、植物及动物个体中，是真菌、藻类的细胞壁及虾、蟹、昆虫等动物外壳的主要组成成分。几丁质酶是一种能够将几丁质彻底降解为n-乙酰氨基葡萄糖单体或寡聚体的糖苷水解酶，能够直接降解真菌细胞壁的主要组分之一—几丁质，使菌丝生长受阻。植物真菌病害一直是影响我国农业生产和食品安全的重要问题。化学杀菌剂的使用带来了严重的环境问题。因此，越来越多的人将目光投向了生物防治。大多数植物病原真菌的细胞壁中主要成分为几丁质，这就使几丁质酶活性菌成为了潜在的抗真菌生防菌株。
3、细菌是几丁质酶的重要来源，已被鉴别的几丁质酶产生菌主要包括气单胞菌属、沙雷氏菌属、肠杆菌属、芽胞杆菌属等，已有研究表明几丁质酶活性菌对多种病原真菌都具有一定的抑制活性，能作为较好的生物防治剂，为了满足
4、因此，为了解决上述技术问题本申请提出一种安达曼链霉菌pl25及其在防治小麦赤霉病中的应用。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种安达曼链霉菌pl25及其在防治小麦赤霉病中的应用。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种安达曼链霉菌pl25的制备，其特征在于：包括如下步骤：
3、s1：选取实验材料，选取红树林根际土进行实验；
4、s2：生防菌的分离纯化，挑取不同形态特征的单菌落进行多次纯化，纯化后的单菌落细菌悬浮于80％的甘油中，置-80℃超低温冰箱中保存；
5、s3：几丁质酶活性测定，包括如下步骤：
6、a、胶体状几丁质的制备，胶体状几丁质的制备：20g甲壳素溶于350ml浓盐酸，4℃放置24h，玻璃棉过滤，滤液加入2l冰无水乙醇(-20℃过夜)，10000r/min离心20min，沉淀用自来水冲洗，直至ph值为中性，冷冻干燥，-20℃密封保存；
7、b、胶体状几丁质为唯一碳源的培养基，在培养基平板上放入灭过菌的滤纸片，两侧滤纸片点悬浮好的菌液，另外两侧点无菌水作为对照，重复3次，28℃培养5d后观察有无透明圈，测量透明圈的内径和外径；
8、s4:几丁质酶活性生防菌的筛选，采用平板对峙培养法，以禾谷镰刀菌为靶标菌，对以上步骤筛选得到的具有几丁质酶活性的菌株进行复筛；
9、s5:产酶和产嗜铁素能力测定，包括如下步骤：
10、a、蛋白酶活性测定，挑取处于生长旺盛期的菌株点于蛋白培养基(a：脱脂奶粉8g，溶于300ml水中，121℃灭菌10min；b：琼脂8g，定容至300ml，121℃灭菌20min，a与b分别灭菌后趁热混匀)，无菌水作为对照，接菌后28℃培养3d观察透明圈有无，分别记录透明圈的内径和外径；
11、b、β-1，3-葡聚糖酶活性测定，挑取处于生长旺盛期的菌株点于葡聚糖平板上(β-1，3-葡聚糖0.1g，tsb 0.4g，琼脂1.6g，4g/l的刚果红1ml，定容至100ml)，无菌水作为对照，接菌后28℃培养3d，观察并测量其透明圈的内径和外径；
12、c、纤维素酶活性测定，挑取处于生长旺盛期的菌株点于纤维素酶活性测定平板(蛋白胨10g，酵母粉10g，羧甲基纤维素钠10g，氯化钠5g，磷酸二氢钾1g，琼脂18g，定容至1000ml，ph＝7.0)，无菌水作为对照，28℃培养3d后，用1g/l的刚果红染1h后，倒掉染液后，用1mol/l的nacl浸泡1h。检测透明圈的有无并且测量其内径和外径；
13、d、产嗜铁素能力测定，a：1，60.5mg cas(铬天青s)溶于50ml去离子水；2，10ml三价铁溶液(1mmol/lfecl3.6h2o，10mmol/l盐酸为溶剂)；3，72.9mg hdtma溶于40ml去离子水。上述三个溶液混合定容至100ml，ph调至中性，121℃灭菌20min。b：30.24g pipes加入900mlwa培养基，12g 50％(w/v)的naoh溶液将培养基ph值调至6.8，121℃灭菌20min。a，b液趁热混匀倒平板，牙签挑取处于生长旺盛期的菌株点于平板，无菌水作为对照，接菌28℃培养5d观察并测量透明圈内径和外径；
14、s6:菌株鉴定包括如下步骤：
15、a、形态鉴定，将具有拮抗效果的菌株在lb固体培养基上用三线法活化，28℃下培养2d，对菌落形态进行观察，经革兰氏染色后，在光学显微镜下对菌体形态进行观察；
16、b、生理生化鉴定，对菌株进行生理生化测定。测定的生理生化特性包括：碳源利用试验、m.r.试验、v.p.试验、硫化氢生成实验、硝酸盐还原实验、明胶液化、过氧化氢酶、淀粉酶；
17、c、分子鉴定，利用16s rdna通用扩增引物(27f：5′-agagtttgatcctggctcag-3′，seq id no:2；1492r：5′-tacggctaccttgttacgactt-3′，seq id no:3)进行菌落pcr。pcr反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸2min，35个循环，最后72℃延伸5min。将获得的pcr产物进行测序，将测得序列在ncbi数据库进行blast比对分析，并从genbank数据库获得同源性高的相关菌株的基因序列，利用mega11软件进行序列多重比对，采用邻接法(neighbor-joining)构建系统发育进化树，最终确定菌株的分类地位。
18、优选地，一种安达曼链霉菌pl25在防治小麦赤霉病中的应用，包括如下步骤：
19、s1：菌株pl25对小麦的促生作用的测定；
20、s2：菌株pl25对小麦赤霉病大田防效测定；
21、s3:菌株pl25发酵提取物对禾谷镰刀菌的抑制作用；
22、s4:菌株pl25对病原菌菌丝形态的影响；
23、s5:菌株pl25对病原菌孢子萌发的影响；
24、s6:菌株pl25对病原菌细胞膜完整性的影响；
25、s7:菌株pl25对病原菌菌丝内ros积累的影响；
26、s8:实验数据本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种安达曼链霉菌PL25的制备，其特征在于：包括如下步骤：
2.一种安达曼链霉菌PL25在防治小麦赤霉病中的应用，其特征在于，包括如下步骤：。
【技术特征摘要】
1.一种安达曼链霉菌pl25的制备，其特征在于：包括如下步骤：
2....
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋春号，许配玲，牛冬冬，陈雯，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。