【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种便于大肠埃希菌基因组中启动子更换的重组质粒、重组工程菌及应用，属于基因工程。
技术介绍
1、大肠埃希菌是目前研究得最清晰、分析得最全面的一种微生物，因其具有易于进行基因水平上的操作、遗传背景清楚、培养成本低等优点一直作为表达外源基因的首选。目前研究人员依赖于应用质粒实现这一过程，即将生物合成所需的包含各基因簇的不同质粒共转化入大肠埃希菌，但面临质粒不稳定性，需要抗生素的选择压力等问题。因此可通过对大肠埃希菌基因改造来对蛋白质进行定向修饰和控制，从而实现糖蛋白的均一性，这样便可大大减少治疗性糖蛋白生产的成本，也成为很多研究者们进行糖蛋白生产的选择。
2、基因表达往往需要启动子的调控，不同强度启动子催化基因转录活性有所差别，所以，为了优化生物合成效率，选择强度适宜的启动子来精细调控相关基因表达至关重要。替换启动子需要重新将整个片段敲入基因组中较为繁琐，对于大片段来说更为困难，如何便捷的替换拟定的启动子成了目前需解决的问题。
技术实现思路
1、为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种便于大肠埃希菌基因组中启动子更换的重组质粒、重组工程菌及应用。为了在后续的实验中可以便捷地替换启动子，且防止在二次基因重组过程中将插入的目的基因簇消除，本专利技术的克隆策略是将含frt位点的kan片段克隆入模块化合成途径的上游，并通过red同源重组技术在大肠埃希菌基因组中实施。
2、为实现上述目的，本专利技术通过以下技术方案进行实现：
3、第一方面
4、第二方面，本专利技术提供了一种重组工程菌，包含所述的重组质粒。
5、进一步地，所述重组工程菌为大肠埃希菌。
6、进一步地，所述大肠埃希菌为大肠埃希菌xl1-blue。
7、第三方面，本专利技术提供了一种所述的重组工程菌的构建方法，将权利要求1或2所述的重组质粒经pcr扩增转入含有pkd46质粒的大肠埃希菌感受态细胞中，获得重组大肠埃希菌，然后将pcp20质粒转导入重组大肠埃希菌中，诱导其表达可识别frt位点的flp重组酶，以将两个frt位点间的靶基因片段消除，得到所述重组工程菌。
8、第四方面，本专利技术提供了一种所述的重组工程菌在生产n-糖基化重组蛋白中的应用。
9、本专利技术以四糖合成模块为例，以本实验室构建的来源于鳆发光杆菌jt-ish-145的α-2，6-唾液酸转移酶plst6(genbank：ab306315.1)和ncbi上提供的neubca基因簇序列(genbank：af400048.1)的质粒pig6-sia为基础载体，引入含有流感嗜血杆菌(haemphilusinflenzae)来源的糖基转移酶lsgcdef基因簇(genbank:m94855,1)、空肠弯曲杆菌(campylobacter jejuni)来源的寡糖翻转酶pglk基因(gene id：905421)、寡糖转移酶pglb基因(gene id：905417)的四糖合成途径替换唾液酸合成途径，在启动子调控的模块化合成途径上游添加含frt位点的kan抗性基因片段。
10、与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
11、本专利技术构建的重组质粒中的启动子上游添加含frt位点的kan抗性基因片段的两端有不同的酶切位点，可以方便更换想要构建的启动子，之后仅通过启动子更换，就能实现对大肠埃希菌基因组多种方式的调控，可使靶蛋白得到更好的表达。另外本专利技术基于red同源重组技术对大肠埃希菌进行改造，可快速、精准的完成大肠埃希菌不同启动子的菌株构建，即：在大肠埃希菌基因组敲入过程中，仅需将带有筛选位点的启动子更换便可以达到不同的效果，为后续对其他模块的优化提供理论基础。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种重组工程菌，其特征在于，包含权利要求1所述的重组质粒。
3.根据权利要求2所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌为大肠埃希菌。
4.根据权利要求3所述的重组工程菌，其特征在于，所述大肠埃希菌为大肠埃希菌XL1-Blue。
5.权利要求2-4中任一项所述的重组工程菌的构建方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的重组质粒经PCR扩增，转入含有pKD46质粒的大肠埃希菌感受态细胞中，获得重组大肠埃希菌，然后将pCP20质粒转导入重组大肠埃希菌中，诱导其表达可识别FRT位点的FLP重组酶，以将两个FRT位点间的靶基因片段消除，得到所述重组工程菌。
6.权利要求2-4中任一项所述的重组工程菌在生产N-糖基化重组蛋白中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.一种重组工程菌，其特征在于，包含权利要求1所述的重组质粒。
3.根据权利要求2所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌为大肠埃希菌。
4.根据权利要求3所述的重组工程菌，其特征在于，所述大肠埃希菌为大肠埃希菌xl1-blue。
5.权利要求2-4中任...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁宁，包紫鑫，胡学军，高玉亭，吴琼，张小梅，郑洋，吕金艳，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：
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