【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物活性肽，特别涉及一种来自牦牛血的新型降血糖肽、发掘方法及应用。
技术介绍
1、糖尿病是一种血糖升高的慢性代谢疾病，通常与肥胖、心血管疾病、神经退行性疾病及慢性炎症有关。据估计，到2035年，全球糖尿病患者人数可能超过5.92亿。二肽基肽酶iv(dpp-iv)是一种糖蛋白，具有裂解肠降血糖素(如葡萄糖依赖性促胰岛素肽、胰高血糖素样肽-1)的活性，通过促进胰岛素分泌在血糖调节中起关键作用。因此，抑制dpp-iv的生物活性是改善糖尿病患者或高血糖人群健康状态的重要策略。目前，许多具有dpp-iv活性抑制能力的药物已经被开发出来并广泛用于糖尿病患者的血糖调节，但其中大多数都伴有不良反应。公开号为“cn107337674a”的专利文献，公开了用作dpp-iv抑制剂的四氢吡喃胺衍生物、其药物组合物和制剂以及用途；该药剂具有良好的dpp-iv抑制活性和优异的药效学性能，以及较低的毒性，但是人体服用后仍有比较大的不良反应。多肽是一种天然来源的低分子量生物活性物质，被认为是其潜在的安全替代物之一。国内外学者已经从骨胶原蛋白、卵清蛋白、油菜籽、鱼皮、牛皮等动植物蛋白及加工副产物中广泛地分离和鉴定出多种dpp-iv抑制肽，如el、er、ka等。这些多肽与dpp-iv之间的相互作用也被广泛研究，但其抑制机制尚不完全清楚。
2、牦牛(bos mutus)是主要生存在海拔>3000米的青藏高原地区的特色物种，被誉为“沙漠之舟”。近年来，牦牛肉因其高蛋白、低脂肪、高多不饱和脂肪酸等特性备受广大消费者的青睐。同时，牦牛骨、血
3、另一方面，发现新型生物活性肽的传统技术途径通常包括酶解、分离、纯化和鉴定，这是一个高耗时、高成本和低产量的过程。最近，随着生物信息学的发展，数据库辅助的计算机模拟方法已经成功地应用于预测和设计具有不同活性的生物活性肽，如dpp-iv抑制、ace抑制肽、抗氧化肽等。此外，分子对接也广泛用于模拟多肽-受体蛋白相互作用，并有助于进一步理解多肽的靶向作用机制。与传统策略相比，计算机辅助筛选和分子对接的应用可以大大节省挖掘新型生物活性肽的时间和成本。公开号为“cn113035291a”的专利文献，公开了一种计算机辅助药物设计dpp-iv抑制肽的方法、dpp-iv抑制肽及其应用；该方法包括建立数据库并划分成内部训练集和外部测试集；构建数据库中多肽的结构；多肽与dpp-iv进行分子对接以选出评分最高的构象；以三肽ipi作为模板分子并以肽键为公共骨架进行叠合；手动调节各个肽的键角提高模型拟合度；用训练集算出测试集中多肽的ic50，并与实验得出的ic50对比；然后导出训练集的等势图来指导设计dpp-iv抑制肽；最后得到新型dpp-iv抑制肽。但是，其筛选的准确性仍然不够好，在筛选过程中会存在遗漏问题。
技术实现思路
1、本专利技术为了解决现有针对糖尿病患者和高血糖人群的dpp-iv抑制物研究过程中所存在的上述技术问题，提供了一种来自牦牛血的新型降血糖肽、发掘方法及应用，它具有无不良反应、筛选准确性较好和节本增效的特点。
2、本专利技术的第一种技术方案：来自牦牛血的新型降血糖肽，所述降血糖肽为dev；所述降血糖肽的氨基酸序列如seq id no：1所示；所述降血糖肽的分子式为c14h23n3o8；所述降血糖肽的分子结构式为，
3、
4、本专利技术中的降血糖肽从牦牛血红蛋白中分离得到，牦牛血红蛋白是牦牛血液中的重要蛋白质资源和生物活性肽的优质来源；本专利技术中的降血糖肽与dpp-iv具有较高的亲和力，能形成稳定的配体-受体复合物，对dpp-iv具有良好的抑制作用；本专利技术中的降血糖肽分子量较低，<500da；具有较高的疏水性(14.71kcal/mol)和水溶性(17.78mol/ml)，感官上呈鲜味、酸味；等电点为3.01，在ph＝7的中性水溶液中带有2个净负电荷；人体肠道吸收概率(hia)接近100％，人体口服生物利用度(hob)为28％，表明具有较高的胃肠道吸收率和口服生物利用率；本专利技术中的降血糖肽对dpp-iv活性的半数最大抑制浓度(ic50值)为339.45μmol/l，能通过较强的氢键作用和静电引力与dpp-iv活性位点s2口袋的核心残基结合，结合力很强，对dpp-iv的生物活性具有很好的抑制性能，作为功能性食品或配料在控制血糖升高方面具有很好的应用前景。
5、本专利技术的第二种技术方案：从牦牛血中发掘新型降血糖肽的方法，包括以下步骤，
6、(a)获得牦牛血红蛋白序列，如seq id no：2所示；
7、(b)通过组合蛋白酶对步骤(a)中牦牛血红蛋白序列进行计算机虚拟酶解后得到多肽序列，如seq id no：3所示；
8、(c)将步骤(b)中的多肽序列逐个与多肽数据库中已知的降血糖肽和同行评审文献报道的降血糖肽进行序列比对，其中与两者序列均不同的多肽，即为潜在新型降血糖肽的筛选肽；
9、(d)选用dpp-iv晶体结构,并对dpp-iv晶体结构进行预处理；
10、(e)构建步骤(c)中所有筛选肽的3d结构，并对构建出的筛选肽3d结构进行预处理；
11、(f)将步骤(e)预处理后的筛选肽3d结构与步骤(d)预处理后的dpp-iv晶体结构进行分子对接，其中能与dpp-iv成功对接且非键结合能为负的筛选肽即为潜在新型降血糖肽的候选肽；
12、(g)将步骤(f)中的候选肽进行固相合成后，得候选新型降血糖肽的合成肽；
13、(i)测定步骤(g)中所有合成肽不同浓度下的dpp-iv抑制率，得到所有合成肽对dpp-iv的半数最大抑制浓度ic50值；
14、(j)选取步骤(i)中ic50值≤1mmol/l的合成肽，即为来自牦牛血的新型降血糖肽。
15、本专利技术首先获得牦牛血红蛋白序列，牦牛血红蛋白是牦牛血液中的主要蛋白质成分之一，同时也是一种优质的生物活性肽资源，增大了牦牛加工副产物血的应用范围；由于牦牛血红蛋白本身是无活性的，本专利技术通过组合蛋白酶对牦牛血红蛋白进行计算机虚拟酶解后得到多肽序列，与单一蛋白酶酶解相比，组合蛋白酶酶解能增加酶解产物的降血糖肽频率值，促使更多的生物活性多肽释放，从而使后续过程中能筛选到更多的具有潜在dpp-iv活性抑制能力的新型肽；本专利技术将酶解后得到的多肽序列逐个与多肽数据库中已知的降血糖肽序列和同行评审文献报道的中已知的降血糖肽序列进行比较，筛选出序列均不同的潜在新型降血糖肽，整个筛选本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.来自牦牛血的新型降血糖肽，其特征是：所述降血糖肽为DEV；所述降血糖肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述降血糖肽的分子式为C14H23N3O8；所述降血糖肽的分子结构式为，
2.从牦牛血中发掘新型降血糖肽的方法，其特征是：包括以下步骤，
3.根据权利要求2所述的从牦牛血中发掘新型降血糖肽的方法，其特征是：所述组合蛋白酶的获得包括以下步骤，
4.根据权利要求3所述的从牦牛血中发掘新型降血糖肽的方法，其特征是：所述步骤(B02)中，通过公式(1)获得降血糖肽频率值，
5.根据权利要求3所述的从牦牛血中发掘新型降血糖肽的方法，其特征是：所述组合蛋白酶的获得过程中，通过BIOPEP-UWM数据库中的Profiles ofPotentialBiologicalActivity工具和Calculations工具，对不同蛋白酶的酶解结果使用公式(1)获得降血糖肽频率值；
6.根据权利要求2所述的从牦牛血中发掘新型降血糖肽的方法，其特征是：所述步骤(D)中，DPP-IV的晶体结构来自Protein Data Bank数据
7.根据权利要求2所述的从牦牛血中发掘新型降血糖肽的方法，其特征是：所述步骤(G)中，将步骤(F)中的候选肽序列通过Fmoc保护的氨基酸合成法进行固相合成后，得潜在新型降血糖肽的合成肽；
8.根据权利要求2所述的从牦牛血中发掘新型降血糖肽的方法，其特征是：所述步骤(I)中，通过S型量效关系方程(2)，采用非线性回归分析法获得半数最大抑制浓度IC50值，
9.根据权利要求2所述的从牦牛血中发掘新型降血糖肽的方法，其特征是：还包括步骤，
10.从牦牛血中发掘新型降血糖肽作为原料在制备血糖调节功能性食品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.来自牦牛血的新型降血糖肽，其特征是：所述降血糖肽为dev；所述降血糖肽的氨基酸序列如seq id no：1所示；所述降血糖肽的分子式为c14h23n3o8；所述降血糖肽的分子结构式为，
2.从牦牛血中发掘新型降血糖肽的方法，其特征是：包括以下步骤，
3.根据权利要求2所述的从牦牛血中发掘新型降血糖肽的方法，其特征是：所述组合蛋白酶的获得包括以下步骤，
4.根据权利要求3所述的从牦牛血中发掘新型降血糖肽的方法，其特征是：所述步骤(b02)中，通过公式(1)获得降血糖肽频率值，
5.根据权利要求3所述的从牦牛血中发掘新型降血糖肽的方法，其特征是：所述组合蛋白酶的获得过程中，通过biopep-uwm数据库中的profiles ofpotentialbiologicalactivity工具和calculations工具，对不同...
【专利技术属性】
技术研发人员：张晋，唐宏刚，赵珂，李欢欢，陈黎洪，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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