【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及新疆野苹果种子休眠调控，具体涉及研究新疆野苹果种子mswrky33基因在低温层积中作用机理的方法。
技术介绍
1、新疆野苹果malus sieversii(ledeb.)roem.属蔷薇科(rosaceaejuss.)，苹果属(malus mill.)，是中亚天山山脉的第三纪孑遗树种，为现代栽培苹果(malus domestica)的起源种，种内变异丰富，在种质资源保存及遗传发育研究中有着不可替代的作用，现已被列为我国的优先保护物种。但由于病虫害及人类活动的干扰，种群繁衍受到严重影响，目前分布面积已不足5000hm2，已于1991年在《中国植物红皮书》中被列为我国濒危二级保护植物。
2、新疆野苹果种群以实生和根蘖繁殖为主要更新繁育方式，实生繁殖方式为主，成熟果实后种植被动物取食后排出、或人为将种子在低温下层积，于来年春季萌发。陈开秀等人对新疆野苹果层积的种子研究发现种子休眠的原因是生理后熟；或是种皮包被导致空气透性不良。而低温层积处理能够有效地软化种皮，增加种子透性，能够促进完成生理变化和后熟过程，降低内源抑制物，增强新陈代谢活动，将贮藏物质转换为简单化合物使胚胎更易吸收，有利于诱导种子解除休眠，是目前新疆野苹果种子休眠解除最常用且最有效的方法。
3、wrky家族是一类广泛分布于植物中的转录因子，通过与转录因子和其他多种基因的自主和交叉调控，在植物的生长、发育和逆境信号传导等过程中发挥多种作用。能够帮助植物抵御不利条件，在作物育种中具有广泛的应用前景。如clwrky20的表达量因盐、干旱和植
4、目前，新疆野苹果基因研究主要集中在抗逆性以及抗病性，而种子的休眠及萌发过程中分子调控机理研究相对较少，而对于新疆野苹果种子mswrky33基因在低温层积中作用机理，在目前的研究中仍是空白，因此亟需设计一种研究新疆野苹果种子mswrky33基因在低温层积中作用机理的方法，以对新疆野苹果种子mswrky33基因在低温层积中作用机理进行探究，以解决上述现有技术存在的问题，为研究新疆野苹果种子的生物学功能及其分子调控休眠机制提供理论基础。
技术实现思路
1、针对上述存在的问题，本专利技术旨在提供研究新疆野苹果种子mswrky33基因在低温层积中作用机理的方法，本方法通过对新疆野苹果(malus sieversii(ledeb.)m.roem.)种子mswrky33进行克隆，并对其进行生物信息学分析、亚细胞定位及不同低温层积时期种子的基因表达量水平检测，揭示了mswrky33基因在新疆野苹果种子低温层积下的功能，为探究其参与休眠调控机理奠定了基础。
2、为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：
3、研究新疆野苹果种子mswrky33基因在低温层积中作用机理的方法，包括
4、步骤s1：mswrky33全长cds序列克隆与基因载体构建；
5、步骤s2：对步骤s1扩增得到的mswrky33进行生物信息学分析；
6、步骤s3：对融合表达载体part-cam-mswrky33-egfp进行亚细胞定位
7、步骤s4：分析mswrky33在不同低温层积时期的表达量。
8、优选的，步骤s1所述的mswrky33全长cds序列克隆与基因载体构建过程包括
9、步骤s1.1：根据基因组mdwrky33的参照cds序列，设计扩增目标基因的特异性引物wrky33f和wrky33r；
10、步骤s1.2：利用pcr一步定向克隆试剂盒，用同源重组的方法，pcr产物一步定向克隆，完成目的片段与载体无缝连接；
11、步骤s1.3：利用基因特异引物wrky33 f和wrky33 r，以新疆野苹果种子cdna为模板，通过pcr的方法克隆目的基因；制备1％琼脂糖凝胶，回收目的片段；
12、步骤s1.4：用xhoi和ecori双酶切质粒cam-egfp，酶切后，琼脂糖凝胶电泳进行结果检测，切取载体大片段对应条带的凝胶，试剂盒回收酶切产物；构建出融合表达载体part-cam-mswrky33-egfp，转化大肠杆菌感受态dh5α；
13、步骤s1.5：转化子经pcr检测后，挑选三个单克隆菌株进行测序得到mswrky33序列；
14、优选的，所述的特异引物wrky33f和wrky33r的引物序列分别为：
15、wrky33 f：5’-atgacttcttccttcacgaacc-3’
16、wrky33 r：5’-gaactcagaaaatccataacttcct-3’。
17、优选的，步骤s2所述的对mswrky33进行生物信息学分析的过程包括
18、步骤s2.1：使用orf finder软件对克隆的序列预测开放阅读框；
19、步骤s2.2：利用ncbi在线软件conserved domain search service分析蛋白质的保守结构域；
20、步骤s2.3：利用ex pasy-prot prama tool在线软件进行蛋白质理化性质分析；利用expasy中的prot salec在线软件分析亲水性和疏水性；利用tmhm软件在线预测跨膜结构，通过signalp本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.研究新疆野苹果种子MsWRKY33基因在低温层积中作用机理的方法，其特征在于：包括
2.根据权利要求1所述的研究新疆野苹果种子MsWRKY33基因在低温层积中作用机理的方法，其特征在于：步骤S1所述的MsWRKY33全长CDS序列克隆与基因载体构建过程包括
3.根据权利要求2所述的研究新疆野苹果种子MsWRKY33基因在低温层积中作用机理的方法，其特征在于：所述的特异引物WRKY33F和WRKY33R的引物序列分别为：
4.根据权利要求1所述的研究新疆野苹果种子MsWRKY33基因在低温层积中作用机理的方法，其特征在于：步骤S2所述的对MsWRKY33进行生物信息学分析的过程包括
5.根据权利要求1所述的研究新疆野苹果种子MsWRKY33基因在低温层积中作用机理的方法，其特征在于：步骤S3所述的对融合表达载体pART-CAM-MsWRKY33-EGFP进行亚细胞定位的过程包括
6.根据权利要求1所述的研究新疆野苹果种子MsWRKY33基因在低温层积中作用机理的方法，其特征在于：步骤S4所述的MsWRKY33在不同低温
7.根据权利要求1所述的研究新疆野苹果种子MsWRKY33基因在低温层积中作用机理的方法，其特征在于：所述的MsWRKY33的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，蛋白序列如SEQ IDNO.2所示。
8.根据权利要求1所述的研究新疆野苹果种子MsWRKY33基因在低温层积中作用机理的方法，其特征在于：
9.根据权利要求8所述的研究新疆野苹果种子MsWRKY33基因在低温层积中作用机理的方法，其特征在于：所述的MsWRKY33蛋白由4种二级结构组成，包括随机卷曲占79.04％；延伸链占9.42％；a-螺旋占8.65％；β转角占2.88％；且在MsWRKY33蛋白的三级结构中，MsWRKY33蛋白由2个α-螺旋元件和2个无规则卷曲元件组成。
10.根据权利要求1所述的研究新疆野苹果种子MsWRKY33基因在低温层积中作用机理的方法，其特征在于：所述的新疆野苹果种子MsWRKY33基因参与低温层积过程中新疆野苹果种子解除休眠的调控。
...【技术特征摘要】
1.研究新疆野苹果种子mswrky33基因在低温层积中作用机理的方法，其特征在于：包括
2.根据权利要求1所述的研究新疆野苹果种子mswrky33基因在低温层积中作用机理的方法，其特征在于：步骤s1所述的mswrky33全长cds序列克隆与基因载体构建过程包括
3.根据权利要求2所述的研究新疆野苹果种子mswrky33基因在低温层积中作用机理的方法，其特征在于：所述的特异引物wrky33f和wrky33r的引物序列分别为：
4.根据权利要求1所述的研究新疆野苹果种子mswrky33基因在低温层积中作用机理的方法，其特征在于：步骤s2所述的对mswrky33进行生物信息学分析的过程包括
5.根据权利要求1所述的研究新疆野苹果种子mswrky33基因在低温层积中作用机理的方法，其特征在于：步骤s3所述的对融合表达载体part-cam-mswrky33-egfp进行亚细胞定位的过程包括
6.根据权利要求1所述的研究新疆野苹果种子mswrky33基因在低温层积中作用机理的方法，其特征在于：步骤...
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