【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及复合生物支架，具体涉及一种外泌体和胶原蛋白海绵生物支架及其制备方法和应用。
技术介绍
1、外泌体是一种由细胞主动分泌的大小均一、直径为50-200nm的脂质双分子层结构囊泡。外泌体作为间充质干细胞的关键旁分泌产物之一，具有类似于亲代间充质干细胞的作用。它们含有蛋白质、信使rna(mrna)和microrna(mirna)以调节受体细胞的活性；与间充质干细胞相比，外泌体更加便于储存和运输，并且避免了与细胞移植相关的许多风险；此外，外泌体还显示出更高的生物稳定性、免疫特性和更容易灌注到组织中的优势，因此外泌体在组织修复再生领域中能够发挥重要作用。
2、理想的生物支架材料包括天然聚合物、合成聚合物和生物陶瓷等。天然聚合物包括各种多糖，以及聚合蛋白质，如明胶、胶原、丝素、纤维蛋白和角蛋白等。其中胶原蛋白是动物中最丰富和最容易获得的蛋白质，具有生物相容性好、来源丰富、是一种天然的生物材料基质。因此胶原蛋白作为天然聚合物具有优异的生物相容性和生物活性，可以实现更好的支架-组织相互作用以及细胞黏附、增殖和最终的组织修复。
3、皮肤覆盖于人体表面，作为抵抗病原体的保护屏障，在人体稳态中起着至关重要的作用。创伤、烧伤和许多慢性疾病都可能导致难治性伤口。随着肥胖和糖尿病发病率的上升，慢性伤口的发病率正在迅速增加。皮肤完整性的严重损害使患者容易出现严重残疾甚至死亡。伤口愈合是一个复杂而动态的细胞信号传递过程和对皮肤损伤的反应，可以分为稳态、炎症、增殖和重塑四个重叠的阶段。干细胞来源的外泌体可以影响伤口愈合的炎症、
技术实现思路
1、为了克服现有技术中由于宿主细胞可以快速清除外泌体并且外泌体在体内的半衰期短等缺点，本专利技术的目的在于提供一种外泌体和胶原蛋白海绵生物支架及其制备方法和应用。
2、本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种外泌体和胶原蛋白海绵生物支架，所述生物支架包含了骨髓间充质干细胞来源的外泌体，将外泌体和胶原蛋白结合在一起形成海绵状的生物支架。
3、优选的，所述骨髓间充质干细胞来源的外泌体的制备方法包括以下步骤：
4、(1)使用全骨髓贴壁法提取骨髓间充质干细胞，即提取骨髓组织，离心后将获得的沉淀用细胞培养液重悬，最后将混合好的细胞培养液接种于细胞培养瓶进行培养；
5、(2)隔天换液，待细胞贴壁并长满瓶底后进行扩增培养；
6、(3)扩增培养后的细胞密度达到80％-90％后，弃去原细胞培养液，使用pbs轻轻清洗贴壁细胞两至三遍，再加入去除了外泌体的细胞培养液继续培养48-72h，收获上清液；
7、(4)将获得的细胞上清液进行密度梯度差速离心，得到骨髓间充质干细胞来源的外泌体。
8、优选的，所述步骤(1)中，提取的骨髓组织的操作步骤为：将2-4周龄的sd大鼠脊椎脱臼处死以后，于质量分数为75％的酒精里浸泡8-12min，然后置于超净工作台；将大鼠的胫骨和股骨解剖离体，除净附着的筋膜肌肉，剪去干骺端，使用无菌注射器吸取适量细胞培养液冲出骨髓至骨头发白。
9、优选的，所述步骤(1)中，离心速度为800-1200rpm，离心时间为3-7min；骨髓间充质干细胞的培养条件为：35-39℃恒温培养箱，体积浓度为4％-6％的co2，相对湿度为92％-98％。
10、优选的，所述步骤(3)中，去除外泌体的细胞培养液采用含有质量分数为8％-12％的特级胎牛血清和质量分数为0.8％-1.2％的青霉素/链霉素双抗的dmem/f12培养基。
11、优选的，所述步骤(4)中，密度梯度差速离心的操作步骤为：将步骤(3)中所获取的细胞上清液在3-5℃温度下首先经150-250ⅹg离心5-15min以去除死细胞，然后经2500-3500ⅹg离心15min去除细胞碎片，再经8000-12000ⅹg离心25-35min去除大颗粒，而后经80000-120000ⅹg离心2.5-3.5h而获得外泌体沉淀，再使用pbs经过80000-120000ⅹg离心2.5-3.5h洗涤外泌体沉淀，并取最终获得的外泌体沉淀。
12、优选的，所述胶原蛋白来源于牛皮组织，属于i型胶原蛋白。
13、胶原蛋白是动物中最丰富和最容易获得的蛋白质，具有生物相容性好、来源丰富、是一种天然的生物材料基质。胶原蛋白基因编码为α-链的长多肽链，其独特的结构特征在于氨基酸基序的区域[gly-x-y]的重复而形成的三螺旋，gly是甘氨酸，x和y一般是脯氨酸和羟脯氨酸，是胶原家族的标志。由于结构的特殊性，胶原蛋白不仅能够提供一定的强度，还具有结构的稳定性和一定的调节功能，在发育和修复的过程中可以提供合适的微环境来支持细胞附着和增殖。i型胶原有良好的生物相容性和低免疫原性，对于i型胶原的开发具有相当高的生物医用价值。
14、本专利技术的另一个目的通过下述技术方案实现：一种外泌体和胶原蛋白海绵生物支架的制备方法，将外泌体与胶原蛋白溶液混合，并在真空冷冻干燥机中冻干形成海绵状的支架。
15、优选的，将所提取的外泌体中加入了海藻酸钠作为冻干保护剂，加入的海藻酸钠与外泌体等体积混合，并使海藻酸钠的质量浓度为8％-12％，在35-39℃温度下平衡25-35min；将平衡好的溶液与胶原蛋白溶液均匀混合，胶原蛋白溶液的质量浓度为6-10mg/ml，继续在35-39℃温度下平衡25-35min，于-75～-85℃预冻10-14h后置于真空冷冻干燥机处理；真空冷冻干燥机的冷阱温度为-40～-60℃，真空压力小于20pa，冷冻干燥处理20-28h，得到外泌体和胶原蛋白海绵生物支架。
16、本专利技术的还一个目的通过下述技术方案实现：一种外泌体和胶原蛋白海绵生物支架在创伤修复中的应用。所述生物支架可在创伤或其他组织修复中作敷料使用。
17、本专利技术的有益效果在于：本专利技术的生物支架使用了骨髓间充质干细胞来源的外泌体，外泌体比间充质干细胞具有更高的生物稳定性、免疫特权和递送更便捷的优势，被用作间充质干细胞的替代品，能够产生与其母细胞相当的治疗效果，在调节免疫功能、炎症、微生物群和组织再生方面具有巨大的潜力，参与组织修复的各种病理生理过程。
18、本专利技术的生物支架将外泌体和胶原蛋白结合在一起形成海绵状生物支架，更好的将外泌体递送，更避免了外泌体易降解、保存困难、在体内的半衰期短等缺点。
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1.一种外泌体和胶原蛋白海绵生物支架，其特征在于：所述生物支架包含了骨髓间充质干细胞来源的外泌体，将外泌体和胶原蛋白结合在一起形成海绵状的生物支架。
2.根据权利要求1所述的一种外泌体和胶原蛋白海绵生物支架，其特征在于：所述骨髓间充质干细胞来源的外泌体的制备方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种外泌体和胶原蛋白海绵生物支架，其特征在于：所述步骤(1)中，提取的骨髓组织的操作步骤为：将2-4周龄的SD大鼠脊椎脱臼处死以后，于质量分数为75％的酒精里浸泡8-12min，然后置于超净工作台；将大鼠的胫骨和股骨解剖离体，除净附着的筋膜肌肉，剪去干骺端，使用无菌注射器吸取适量细胞培养液冲出骨髓至骨头发白。
4.根据权利要求2所述的一种外泌体和胶原蛋白海绵生物支架，其特征在于：所述步骤(1)中，离心速度为800-1200rpm，离心时间为3-7min；骨髓间充质干细胞的培养条件为：35-39℃恒温培养箱，体积浓度为4％-6％的CO2，相对湿度为92％-98％。
5.根据权利要求2所述的一种外泌体和胶原蛋白海绵生物支架，其特征在于：所述
6.根据权利要求2所述的一种外泌体和胶原蛋白海绵生物支架，其特征在于：所述步骤(4)中，密度梯度差速离心的操作步骤为：将步骤(3)中所获取的细胞上清液在3-5℃温度下首先经150-250ⅹg离心5-15min以去除死细胞，然后经2500-3500ⅹg离心15min去除细胞碎片，再经8000-12000ⅹg离心25-35min去除大颗粒，而后经80000-120000ⅹg离心2.5-3.5h而获得外泌体沉淀，再使用PBS经过80000-120000ⅹg离心2.5-3.5h洗涤外泌体沉淀，并取最终获得的外泌体沉淀。
7.根据权利要求1所述的一种外泌体和胶原蛋白海绵生物支架，其特征在于：所述胶原蛋白来源于牛皮组织，属于I型胶原蛋白。
8.如权利要求1-7任一项所述的一种外泌体和胶原蛋白海绵生物支架的制备方法，其特征在于：将外泌体与胶原蛋白溶液混合，并在真空冷冻干燥机中冻干形成海绵状的支架。
9.根据权利要求8所述的一种外泌体和胶原蛋白海绵生物支架的制备方法，其特征在于：将所提取的外泌体中加入了海藻酸钠作为冻干保护剂，加入的海藻酸钠与外泌体等体积混合，并使海藻酸钠的质量浓度为8％-12％，在35-39℃温度下平衡25-35min；将平衡好的溶液与胶原蛋白溶液均匀混合，胶原蛋白溶液的质量浓度为6-10mg/mL，继续在35-39℃温度下平衡25-35min，于-75～-85℃预冻10-14h后置于真空冷冻干燥机处理；真空冷冻干燥机的冷阱温度为-40～-60℃，真空压力小于20Pa，冷冻干燥处理20-28h，得到外泌体和胶原蛋白海绵生物支架。
10.如权利要求1-7任一项所述的一种外泌体和胶原蛋白海绵生物支架在创伤修复中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种外泌体和胶原蛋白海绵生物支架，其特征在于：所述生物支架包含了骨髓间充质干细胞来源的外泌体，将外泌体和胶原蛋白结合在一起形成海绵状的生物支架。
2.根据权利要求1所述的一种外泌体和胶原蛋白海绵生物支架，其特征在于：所述骨髓间充质干细胞来源的外泌体的制备方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种外泌体和胶原蛋白海绵生物支架，其特征在于：所述步骤(1)中，提取的骨髓组织的操作步骤为：将2-4周龄的sd大鼠脊椎脱臼处死以后，于质量分数为75％的酒精里浸泡8-12min，然后置于超净工作台；将大鼠的胫骨和股骨解剖离体，除净附着的筋膜肌肉，剪去干骺端，使用无菌注射器吸取适量细胞培养液冲出骨髓至骨头发白。
4.根据权利要求2所述的一种外泌体和胶原蛋白海绵生物支架，其特征在于：所述步骤(1)中，离心速度为800-1200rpm，离心时间为3-7min；骨髓间充质干细胞的培养条件为：35-39℃恒温培养箱，体积浓度为4％-6％的co2，相对湿度为92％-98％。
5.根据权利要求2所述的一种外泌体和胶原蛋白海绵生物支架，其特征在于：所述步骤(3)中，去除外泌体的细胞培养液采用含有质量分数为8％-12％的特级胎牛血清和质量分数为0.8％-1.2％的青霉素/链霉素双抗的dmem/f12培养基。
6.根据权利要求2所述的一种外泌体和胶原蛋白海绵生物支架，其特征在于：所述步骤(4)中，密度梯度差速离心的操作步骤为：将步骤(3)中所获取的细胞上清液在3-5℃温...
【专利技术属性】
技术研发人员：周艳芳，彭新生，王婷禹，
申请(专利权)人：东莞胶原生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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