【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学，具体涉及一种在鸡原代肌内脂肪细胞中稳定过表达的cx3cl1慢病毒重组载体的构建方法及应用。
技术介绍
1、肌内脂肪是动物肌肉的重要组成部分，存在于肌纤维内部和肌束之间，是评价肉品质好坏的最重要的指标之一。肌内脂肪含量与肌肉的嫩度、风味及多汁性呈显著正相关，与肌肉的ph和系水力密切相关。因此，培育高肌内脂肪含量的肉鸡新品种/专门化品系是现代肉鸡育种的目标，而挖掘出肌内脂肪沉积相关的关键功能基因将缩短高肌内脂肪肉鸡新品种/系培育的世代间隔。
2、趋化因子cx3cl1，是cx3c一类趋化因子中唯一的成员。cx3cl1在小鼠的睾丸、大脑、心和骨骼肌等组织中都有表达。cx3cl1可激活mapk、钙调蛋白、酪氨酸蛋白激酶等通路，进而调控骨骼肌的增殖与分化。在鸡上，cx3cl1在胚胎期到生长期鸡的胸、腿肌中表达，而cx3cl1与脂肪沉积的关系尚未见报道。且鸡原代肌内脂肪细胞较难转染，转染效率低下，导致体外功能基因鉴定的研究难以有效开展。
技术实现思路
1、本专利技术针对上述现有技术存在的问题，提供一种在鸡原代肌内脂肪细胞中稳定过表达的cx3cl1慢病毒重组载体的构建及应用。
2、首先根据genebank上公布的cx3cl1基因的cds序列，利用全基因组合成的方法钓取目的基因，进一步地将cx3cl1基因与lv5载体序列分别进行酶切，纯化酶切产物后进行连接，将连接产物转化到top10感受态细胞，对阳性克隆进行测序和分析比对，序列比对完全正确的即为构建
3、为实现上述目的，本专利技术通过以下方案实现：
4、第一方面，本专利技术提供一种在鸡原代肌内脂肪细胞中稳定过表达的cx3cl1慢病毒重组载体，所述cx3cl1慢病毒重组载体包含鸡cx3cl1基因，载体为lv5载体。
5、第二方面，本专利技术提供一种所述的在鸡原代肌内脂肪细胞中稳定过表达的cx3cl1慢病毒重组载体的构建方法，所述方法如下：
6、步骤1，获取鸡cx3cl1基因全长cds扩增产物；
7、步骤2，将cx3cl1基因全长cds扩增产物进行酶切；
8、步骤3，将lv5载体进行酶切；
9、步骤4，纯化步骤2得到的酶切产物和步骤3得到的酶切产物后进行连接；
10、步骤5，将步骤4得到的连接产物转化到top10感受态细胞，对阳性克隆进行测序和分析比对，序列比对完全正确的即为构建成功的cx3cl1基因表达载体质粒；
11、步骤6，将构建好的cx3cl1基因表达载体质粒进行超纯抽提，将抽取的质粒进行包装，将包装质粒与抽取的cx3cl1基因表达载体质粒共转染到293t细胞，进行慢病毒的包装、收集，进行滴度检测，得到cx3cl1慢病毒重组载体。
12、进一步地，步骤1所述的获取鸡cx3cl1基因全长cds扩增产物，具体步骤如下：
13、步骤1.1，根据cx3cl1 cds序列利用oligo软件设计引物，cx3cl1序列如seq idno.37所示，cx3cl1基因上下游引物两端含有noti和bamhi酶切位点及保护碱基，用于载体的亚克隆，引物如下所示：
14、
15、
16、
17、步骤1.2，将引物oligo-1至oligo-36分别用超纯水溶解成50μm浓度，之后分别取相同体积至一1.5ml离心管，混合均匀，配成oligo mix，用配好的oligo mix进行第一轮pcr反应；第一轮pcr反应体系为：oligo mix：2μl，10×pfu buffer(+mg2+)：3μl，dntp：0.6μl，dmso:1.2μl,ddh2o:23μl,pfu dna polymerase:0.2μl；pcr反应条件为：95℃3min，1个循环；95℃22sec、58℃22sec、72℃40sec，22个循环；72℃5min，1个循环；
18、步骤1.3，用引物oligo-1和oligo-36进行第二轮pcr反应，第二轮pcr反应体系为：第一轮pcr产物：1μl，10×pfu buffer(+mg2+)：5μl，dntp：1μl，dmso：2μl，oligo-1：1μl，oligo-36：1μl，ddh2o：39μl，pfu dna polymerase：0.3μl；pcr反应条件为：95℃3min，1个循环；95℃22sec、58℃22sec、72℃40sec，32个循环；72℃5min，1个循环；pcr反应结束后利用agarose电泳并切胶回收基因片段。
19、进一步地，步骤2所述的将cx3cl1基因全长cds扩增产物进行酶切，具体如下：用noti和bamhi对cx3cl1基因全长cds产物进行酶切，37℃酶切2小时，酶切体系为10×buffer：5μl，cx3cl1基因全长cds产物：42μl，bamhi和noti各1.5μl。
20、进一步地，步骤3所述的将lv5载体进行酶切，具体如下：用noti和bamhi对lv5载体进行酶切，37℃酶切2小时，酶切体系为：10×buffer：5μl，lv5：5ug，bamhi和noti各1.5μl，超纯水补足50μl。
21、进一步地，步骤4所述的纯化步骤2得到的酶切产物和步骤3得到的酶切产物后进行连接，具体如下：用dna凝胶回收试剂盒回收cx3cl1基因全长cds产物和载体lv5；用t4dna ligase连接双酶切得到的cx3cl1基因片段和线性化lv5载体，22℃连接2小时，连接体系为：t4 dnaligase buffer:2μl，lv5：2μl，cx3cl1基因全长cds产物：5μl，t4 dnaligase：1μl，ddh2o：10μl。
22、进一步地，步骤5所述的将步骤4得到的连接产物转化到top10感受态细胞，具体如下：将10μl连接产物加入到有感受态细胞的离心管中，轻柔混匀，在冰中放置30分钟；将离心管放到预加温到42℃的水浴锅中，放置90秒，不要摇动离心管；快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却3分钟，向每支离心管加入800μl不含抗生素的lb培养基，然后将离心管转移到37℃摇床，250转/分钟，培育45分钟使细菌复苏；取200μl培育后的细胞均匀涂布于含50μg/ml ampicillin lb平板上，等平板上液体被吸收后，将平板倒置于37℃培养箱中，培养16小时。
23、进一步地，步骤6所述的包装质粒为pgag/pol、prev和pvsv-g。
24、进一步地，步本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种在鸡原代肌内脂肪细胞中稳定过表达的CX3CL1慢病毒重组载体，其特征在于，所述CX3CL1慢病毒重组载体包含鸡CX3CL1基因，载体为LV5载体。
2.权利要求1所述的在鸡原代肌内脂肪细胞中稳定过表达的CX3CL1慢病毒重组载体的构建方法，其特征在于，所述方法如下：
3.根据权利要求2所述的在鸡原代肌内脂肪细胞中稳定过表达的CX3CL1慢病毒重组载体的构建方法，其特征在于，步骤1所述的获取鸡CX3CL1基因全长CDS扩增产物，具体步骤如下：
4.根据权利要求2所述的在鸡原代肌内脂肪细胞中稳定过表达的CX3CL1慢病毒重组载体的构建方法，其特征在于，步骤2所述的将CX3CL1基因全长CDS扩增产物进行酶切，具体如下：用NotI和BamHI对CX3CL1基因全长CDS产物进行酶切，37℃酶切2小时，酶切体系为10×Buffer：5μl，CX3CL1基因全长CDS产物：42μl，BamHI和NotI各1.5μl。
5.根据权利要求2所述的在鸡原代肌内脂肪细胞中稳定过表达的CX3CL1慢病毒重组载体的构建方法，其特征在于，步骤3所述
6.根据权利要求2所述的在鸡原代肌内脂肪细胞中稳定过表达的CX3CL1慢病毒重组载体的构建方法，其特征在于，步骤4所述的纯化步骤2得到的酶切产物和步骤3得到的酶切产物后进行连接，具体如下：用DNA凝胶回收试剂盒回收CX3CL1基因全长CDS产物和载体LV5；用T4 DNA ligase连接双酶切得到的CX3CL1基因片段和线性化LV5载体，22℃连接2小时，连接体系为：T4 DNA ligase buffer:2μl，LV5：2μl，CX3CL1基因全长CDS产物：5μl，T4 DNAligase：1μl，ddH2O：10μl。
7.根据权利要求2所述的在鸡原代肌内脂肪细胞中稳定过表达的CX3CL1慢病毒重组载体的构建方法，其特征在于，步骤5所述的将步骤4得到的连接产物转化到TOP10感受态细胞，具体如下：
8.根据权利要求2所述的在鸡原代肌内脂肪细胞中稳定过表达的CX3CL1慢病毒重组载体的构建方法，其特征在于，步骤6所述的包装质粒为pGag/Pol、pRev和pVSV-G。
9.根据权利要求2所述的在鸡原代肌内脂肪细胞中稳定过表达的CX3CL1慢病毒重组载体的构建方法，其特征在于，步骤6所述的将包装质粒与抽取的CX3CL1基因表达载体质粒共转染到细胞，进行慢病毒的包装、收集，进行滴度检测，具体如下：
10.权利要求1所述的过表达CX3CL1慢病毒重组载体在鸡原代肌内脂肪细胞中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种在鸡原代肌内脂肪细胞中稳定过表达的cx3cl1慢病毒重组载体，其特征在于，所述cx3cl1慢病毒重组载体包含鸡cx3cl1基因，载体为lv5载体。
2.权利要求1所述的在鸡原代肌内脂肪细胞中稳定过表达的cx3cl1慢病毒重组载体的构建方法，其特征在于，所述方法如下：
3.根据权利要求2所述的在鸡原代肌内脂肪细胞中稳定过表达的cx3cl1慢病毒重组载体的构建方法，其特征在于，步骤1所述的获取鸡cx3cl1基因全长cds扩增产物，具体步骤如下：
4.根据权利要求2所述的在鸡原代肌内脂肪细胞中稳定过表达的cx3cl1慢病毒重组载体的构建方法，其特征在于，步骤2所述的将cx3cl1基因全长cds扩增产物进行酶切，具体如下：用noti和bamhi对cx3cl1基因全长cds产物进行酶切，37℃酶切2小时，酶切体系为10×buffer：5μl，cx3cl1基因全长cds产物：42μl，bamhi和noti各1.5μl。
5.根据权利要求2所述的在鸡原代肌内脂肪细胞中稳定过表达的cx3cl1慢病毒重组载体的构建方法，其特征在于，步骤3所述的将lv5载体进行酶切，具体如下：用noti和bamhi对lv5载体进行酶切，37℃酶切2小时，酶切体系为：10×buffer：5μl，lv5：5ug，bamhi和noti各1.5μl，超纯水补足50μl。
6.根据权利要求2所...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄华云，梁忠，赵振华，韩威，李春苗，王钱保，黄正洋，吴兆林，李国辉，李瑞瑞，杨苗苗，
申请(专利权)人：江苏省家禽科学研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。