【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种肝细胞冻存液及其应用。
技术介绍
1、原代肝细胞(primary hepatocytes)是指从动物肝脏直接分离的肝实质细胞。原代肝细胞已广泛应用于药物代谢途径、药代动力学、药物相互作用、药物肝脏毒性研究等方面。目前“两步灌流法”是应用最广泛的体外肝细胞分离技术，但细胞分离技术难、供体差异大、长期保存困难、组织获取受限等诸多因素限制了新鲜肝细胞的使用。因此为了克服这些困难，冷冻肝细胞技术发展起来。
2、目前细胞的长期保存主要是应用液氮冷冻保存法。通常情况下，液体冻结时会对细胞造成损伤，其中，一种情况是由于不适当的降温和复温导致细胞内形成冰晶和重结晶；另一种情况是由于冷冻使得电解质和溶质浓度升高所导致的溶质损伤。因此选择一种合适的细胞冻存保护液至关重要。
3、目前的冻存液有很多种，常规细胞冻存会根据细胞的特性进行调整冻存液的比例，通常包括5％-10％的dmso(二甲基亚砜)、20％-90％的血清以及0％-70％的基础培养液，但使用血清容易引起动物来源的病毒污染，而且此种冻存液冻存的肝细胞存活率以及细胞活性较低，直接制约该种冻存液在冻存肝细胞中的应用。
4、商业化的干细胞冻存液有cryostorcs10冻存液，生产厂家为biolifesolutions，该种冻存液除含有已知10％的dmso外其他成分不详，该种冻存液对于常规干细胞如cho细胞、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞、骨髓间充质干细胞表现出较好的冻存效果，但应用于肝细胞冻存并未显现其优越性。同时有研究发现使用cryos
5、除上述常规冻存液之外，uw器官保护液(university of wisconsin solution)是指在器官移植中用来保存供体器官的保存液，主要含有乳糖酸，是主要非渗透性阴离子，分子量相对较大，能减轻冷藏时细胞的肿胀，也是肝细胞常用冻存液的主要组分。uw器官保护液作为肝细胞冻存液，冻存配方按其体积百分比计算，包括：5％-15％的dmso、8％-15％的fbs(胎牛血清，fetal bovine serum)、以及60％-84％的uw器官保护液。该配方在冻存复苏后肝细胞活率方面较传统冻存液高，但受限于uw器官保护液来源、价格较高等因素，其较难在大批量肝细胞冻存中使用。
6、因此探究一款来源不受限制、不影响细胞活率和冻存后细胞使用范围的肝细胞冻存液至关重要。
技术实现思路
1、为解决上述技术难题，特提出本专利技术。
2、首先，本专利技术提供了一种肝细胞冻存液，由以下组分组成：
3、dmem培养基、fbs、dmso、缓冲物质、pvp、海藻糖、维生素e和青链霉素混合物。
4、本专利技术发现，上述配方中的各组分能够协同发挥对肝细胞的保护作用，使得肝细胞在冻存后仍然具有较高的细胞活率，而且肝细胞贴壁能力强、具有较广的细胞使用范围。
5、其中，海藻糖和维生素e能够与体系中的fbs协同发挥肝细胞保护和修复的功能，提高冻存后肝细胞的存活率以及代谢活性。体系中的dmso和pvp(聚乙烯吡咯烷酮)能够协同降低冰晶对肝细胞的损伤，与海藻糖、维生素e以及fbs协同发挥保护肝细胞的作用。
6、而且体系中的fbs也具有一定的缓冲作用，在肝细胞冻存过程中与缓冲物质协同发挥缓冲作用，保护肝细胞。此外，体系中的fbs和dmem培养基共同为肝细胞提供适宜的营养支持。
7、优选地，海藻糖的浓度为0.1～0.5m。
8、优选地，维生素e的浓度为1～5mm。
9、优选地，pvp的质量浓度为2％～8％；即pvp与所述肝细胞冻存液的质量体积比为2～8g：100ml。
10、优选地，所述缓冲物质为hepes(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，其浓度为5～15mm。
11、优选地，所述dmem培养基的体积占所述肝细胞冻存液总体积的60％～75％；
12、和/或，fbs的体积占所述肝细胞冻存液总体积的15％～25％；
13、和/或，dmso的体积占所述肝细胞冻存液总体积的5％～15％。
14、更优选地，dmso的体积占所述肝细胞冻存液总体积的8％～12％。
15、所述青链霉素混合物包括青霉素g钠盐和硫酸链霉素；其中，青霉素g钠盐的浓度为5000～20000u/ml，硫酸链霉素的浓度为5～15mg/ml。
16、优选地，所述青链霉素混合物的体积占所述肝细胞冻存液总体积的0.5％～2％，较优选为0.5％～1.5％；更优选为1％。
17、0.5％～2％即青链霉素混合物的体积与所述肝细胞冻存液的体积比为0.5～2ml：100ml。
18、优选地，所述肝细胞冻存液由以下组分组成：
19、dmem培养基、fbs、dmso、5～15mm的hepes、质量浓度为2％～8％的pvp、0.1～0.5m的海藻糖、1～5mm的维生素e以及青链霉素混合物；
20、其中，dmem培养基占所述肝细胞冻存液总体积的60％～75％；
21、fbs占所述肝细胞冻存液总体积的15％～25％；
22、dmso占所述肝细胞冻存液总体积的5％～15％。
23、更优选地，所述肝细胞冻存液由以下组分组成：
24、dmem培养基、fbs、dmso、5～10mm的hepes、质量浓度为2％～6％的pvp、0.1～0.3m的海藻糖、1～3mm的维生素e以及青链霉素混合物；
25、其中，dmem培养基占所述肝细胞冻存液总体积的65％～75％；
26、fbs占所述肝细胞冻存液总体积的15％～20％；
27、dmso占所述肝细胞冻存液总体积的5％～15％。
28、最优选地，所述肝细胞冻存液由以下组分组成：
29、dmem培养基、fbs、dmso、8～10mm的hepes、质量浓度为4％～6％的pvp、0.15～0.3m的海藻糖、1.5～3mm的维生素e以及青链霉素混合物；
30、其中，dmem培养基占所述肝细胞冻存液总体积的65％～72％；
31、fbs占所述肝细胞冻存液总体积的18％～20％；
32、dmso占所述肝细胞冻存液总体积的5％～15％。
33、进一步，本专利技术提供了一种试剂或试剂盒，其中含有上述任一方案中的肝细胞冻存液。
34、进一步，本专利技术提供了上述任一方案中的肝细胞冻存液、试剂或试剂盒在保存肝细胞中的应用。
35、优选地，本专利技术中的肝细胞为原代肝细胞。
36、与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
37、本专利技术提供了一款使用方便、来源不受限制、不影响细胞活率和冻存后细胞使用范围的肝细胞冻存液，该冻存液针本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种肝细胞冻存液，其特征在于，由以下组分组成：
2.根据权利要求1所述的肝细胞冻存液，其特征在于，维生素E的浓度为1～5mM。
3.根据权利要求2所述的肝细胞冻存液，其特征在于，海藻糖的浓度为0.1～0.5M。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的肝细胞冻存液，其特征在于，PVP的质量浓度为2％～8％。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的肝细胞冻存液，其特征在于，所述缓冲物质为HEPES，其浓度为5～15mM。
6.根据权利要求1～3中任一项所述的肝细胞冻存液，其特征在于，所述DMEM培养基的体积占所述肝细胞冻存液总体积的60％～75％；
7.根据权利要求1所述的肝细胞冻存液，其特征在于，由以下组分组成：
8.一种试剂或试剂盒，其特征在于，其中包含权利要求1～7中任一项所述的肝细胞冻存液。
9.权利要求1～7中任一项所述的肝细胞冻存液、或权利要求8所述的试剂或试剂盒在保存肝细胞中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种肝细胞冻存液，其特征在于，由以下组分组成：
2.根据权利要求1所述的肝细胞冻存液，其特征在于，维生素e的浓度为1～5mm。
3.根据权利要求2所述的肝细胞冻存液，其特征在于，海藻糖的浓度为0.1～0.5m。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的肝细胞冻存液，其特征在于，pvp的质量浓度为2％～8％。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的肝细胞冻存液，其特征在于，所述缓冲物质为hepes，其浓...
【专利技术属性】
技术研发人员：王倩，刘鸿君，杜克贺，刘勇，王艳萍，王华笑，
申请(专利权)人：北京汇智泰康医药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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