【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医药，具体涉及一种肿瘤微环境响应的双基因敲除制剂的制备方法及其应用。
技术介绍
1、crispr/cas9基因编辑系统因其简单性和多功能性，近年来得到迅速发展，并在癌症治疗中显示了巨大的前景。然而，如何高效、精准的递送仍然存在很多挑战。肿瘤细胞由于其快速增殖和侵袭特性，其生长微环境与正常细胞相比具有许多不同的特征。因此，开发具有肿瘤微环境响应的功能纳米材料，用于递送crispr/cas9，并实现响应性释放，以实现安全且高效的肿瘤细胞重编程具有重要意义。
2、肿瘤细胞的免疫逃逸主要是由于整合素相关蛋白cd47与肿瘤相关巨噬细胞(tams)上的信号调节蛋白α(sirpα)相互作用，从而保护肿瘤细胞不被识别和消除。同时，脂肪细胞质膜相关蛋白(apmap)可以与cd47产生协同效应。因此，使用crispr/cas9系统敲除肿瘤细胞中的cd47和apmap基因序列，降低蛋白表达水平，抑制抗吞噬信号的传递，从而阻断肿瘤细胞的免疫逃逸。
3、此外，活性氧(ros)被证明能够使tams从促肿瘤m2表型极化为抗肿瘤m1表型，从而抑制肿瘤的进展和复发。由于肿瘤微环境呈弱酸性并且过氧化氢水平高于正常细胞，为非生物过渡金属的芬顿/类芬顿催化反应提供了有利的反应条件，产生大量高毒性ros。这不仅可以触发化学动力学介导的肿瘤凋亡途径，还可以诱导tams发生m1极化，激活其抗肿瘤作用。同时，一些过渡金属也被认为是生物正交激活抗肿瘤前药的潜在候选药物，可以降低化疗毒副作用，同时招募更多的tams以增强治疗效。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种安全高效的肿瘤微环境响应的双基因敲除制剂的制备方法及其应用。该纳米制剂由crispr/cas9基因编辑系统、免疫调节剂及肿瘤靶向修饰层构成，并可以与抗肿瘤前药进行联用。
2、为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：第一方面，本申请提供一种肿瘤微环境响应的双基因敲除制剂；第二方面，本申请提供一种肿瘤微环境响应的双基因敲除制剂的制备方法；
3、第三方面，本申请提供一种所述肿瘤微环境响应型双基因敲除制剂在抗肿瘤治疗中的应用。
4、第四方面，本申请提供一种本专利技术所述肿瘤微环境响应的双基因敲除制剂与抗肿瘤前药进行联用在制备抗肿瘤药物中的应用。
5、本专利技术的一种肿瘤微环境响应的双基因敲除制剂，肿瘤微环境响应的双基因敲除制剂由crispr/cas9双基因编辑系统、免疫调节剂和肿瘤靶向修饰层组成，并可以与抗肿瘤前药进行联用。
6、进一步地，crispr/cas9基因敲除系统由cas9蛋白与两段向导rna(sgrna)复合而成，其中一段sgrna为cd47蛋白基因序列，另一段sgrna为脂肪细胞膜关联蛋白(apmap)基因序列。
7、进一步地，免疫调节剂为过渡金属纳米簇，所述过渡金属纳米簇包括金纳米簇、铂纳米簇、钯纳米簇或钌纳米簇中的一种或几种的组合，通过生物矿化的方式进行制备，尺寸小于5.5nm，可通过肾脏代谢，减少金属在体内的累积，降低毒副作用；过渡金属纳米簇免疫调节剂，由生物矿化方法制备，采用包括牛血清蛋白、人血清蛋白、葡萄糖氧化酶等生物活性蛋白进行矿化。所述过渡金属纳米簇在肿瘤微环境中可以与过表达的过氧化氢发生芬顿或类芬顿催化反应，产生大量活性氧，诱导肿瘤相关巨噬细胞m1极化，激活其抗肿瘤功能。具有生物正交催化功能，可以激活抗肿瘤前药进行化疗，降低化疗毒副作用。
8、肿瘤靶向修饰层由具有肿瘤靶向性的功能材料构成，所述具有肿瘤靶向性的功能材料包括透明质酸、plga、peg、rdg靶向肽、整合素受体或细胞膜中的任意一种，修饰在纳米粒子表面，实现肿瘤部位特异性富集；所述免疫调节剂通过肿瘤微环境响应性功能分子进行连接，所述肿瘤微环境响应性功能分子包括活性氧响应性功能分子(缩硫酮)、乏氧响应性功能分子(偶氮键)或谷胱甘肽响应性功能分子(二硫键)中的任意一种。
9、更进一步地，crispr/cas9双基因编辑系统的建立：在ph为7.4的tris-hcl缓冲液中，以1:3的cas9:sgrna质量比将cas9蛋白与sgrna在37℃下孵育10分钟，以形成cas9/sgrna复合物；其中，目标基因为cd47和apmap，所述cd47目标基因的sgrna序列的序列为seqid no.1所示的核苷酸序列，所述apmap目标基因的sgrna序列为seq id no.2所示的核苷酸序列。cd47目标基因的sgrna序列为：5’-tatagagctgaaaaaccgca-3’，apmap目标基因的sgrna序列为：5’-gtcccggaggtcaagga-3’。crispr/cas9基因编辑系统，通过敲除肿瘤细胞内cd47和apmap基因表达，降低cd47和apmap蛋白水平，抑制肿瘤细胞免疫逃逸，提高巨噬细胞吞噬功能。
10、本专利技术的一种肿瘤微环境响应的双基因敲除制剂的制备方法，包括如下步骤：crispr/cas9和免疫调节剂通过肿瘤微环境响应的功能分子进行连接，随后在其表面进行肿瘤靶向修饰，形成稳定的纳米颗粒，制得肿瘤微环境响应的双基因敲除制剂。
11、进一步地，采用活性氧响应性功能分子缩硫酮对crispr/cas9和免疫调节剂bpd进行连接，然后在表面修饰肿瘤靶向性材料透明质酸：(1)0.1mg ml-1bpd溶液由制备的bpd溶液稀释制得，与500nm的cas9/sgrna复合物和50μm的缩硫酮溶液混合，在4℃下搅拌过夜；(2)用1000d透析袋在去离子水中纯化所制备的纳米配合物，透析24h，得到bpdc；(3)将0.1mg ml-1的bpdc与0.5mg ml-1的透明质酸溶液(mw 5000d)在室温下搅拌30min，用10kd的透析袋在去离子水中纯化所制备的纳米配合物，透析12h，以获得hbpdc，并在4℃下保存，制得肿瘤微环境响应的双基因敲除制剂hbpdc制剂。
12、更进一步地，钯纳米簇bpd的制备方法：采用生物矿化法制备钯纳米簇，具体制备方法：将0.01m氯钯酸溶液加入到20mg ml-1的牛血清蛋白溶液中，搅拌2min后加入1m氢氧化钠，并在37℃下搅拌反应12h，制得牛血清蛋白矿化的钯纳米簇bpd溶液。
13、本专利技术肿瘤微环境响应型双基因敲除制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
14、本专利技术肿瘤微环境响应的双基因敲除制剂与抗肿瘤前药进行联用在制备抗肿瘤药物中的应用。
15、有益效果：本专利技术的制剂静脉注射后在肿瘤部位高度富集，并响应性释放crispr/cas9和免疫微环境调节剂，药物转染效率高，能够重塑肿瘤免疫微环境，增强巨噬细胞抗肿瘤吞噬功能，实现安全高效的肿瘤治疗，具有良好的生物安全性和广泛的应用前景。
16、与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：(1)具有肿瘤靶向功能，可降低药物毒副作用，提高治疗本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种肿瘤微环境响应的双基因敲除制剂，其特征在于：所述肿瘤微环境响应的双基因敲除制剂由CRISPR/Cas9双基因编辑系统、免疫调节剂和肿瘤靶向修饰层组成，并可以与抗肿瘤前药进行联用。
2.根据权利要求1所述的肿瘤微环境响应的双基因敲除制剂，其特征在于：CRISPR/Cas9基因敲除系统由Cas9蛋白与两段向导RNA复合而成，其中一段sgRNA为CD47蛋白基因序列，另一段sgRNA为脂肪细胞膜关联蛋白APMAP基因序列。
3.根据权利要求1所述的肿瘤微环境响应的双基因敲除制剂，其特征在于：所述免疫调节剂为过渡金属纳米簇，所述过渡金属纳米簇包括金纳米簇、铂纳米簇、钯纳米簇或钌纳米簇中的一种或几种的组合，通过生物矿化的方式进行制备，尺寸小于5.5nm，可通过肾脏代谢，减少金属在体内的累积，降低毒副作用；所述肿瘤靶向修饰层由具有肿瘤靶向性的功能材料构成，所述具有肿瘤靶向性的功能材料包括透明质酸、PLGA、PEG、RDG靶向肽、整合素受体或细胞膜中的任意一种，修饰在纳米粒子表面，实现肿瘤部位特异性富集；所述免疫调节剂通过肿瘤微环境响应性功能分子进行连接，所述肿
4.根据权利要求2所述的肿瘤微环境响应的双基因敲除制剂，其特征在于：CRISPR/Cas9双基因编辑系统的建立：在pH为7.4的Tris-HCl缓冲液中，以1:3的Cas9:sgRNA质量比将Cas9蛋白与sgRNA在37℃下孵育10分钟，以形成Cas9/sgRNA复合物；其中，目标基因为CD47和APMAP，所述CD47目标基因的sgRNA序列的序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述APMAP目标基因的sgRNA序列为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
5.权利要求1至4任一项所述的肿瘤微环境响应的双基因敲除制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：CRISPR/Cas9和免疫调节剂通过肿瘤微环境响应的功能分子进行连接，随后在其表面进行肿瘤靶向修饰，形成稳定的纳米颗粒，制得肿瘤微环境响应的双基因敲除制剂。
6.根据权利要求5所述的肿瘤微环境响应的双基因敲除制剂的制备方法，其特征在于：采用活性氧响应性功能分子缩硫酮对CRISPR/Cas9和免疫调节剂BPd进行连接，然后在表面修饰肿瘤靶向性材料透明质酸：
7.根据权利要求6所述的肿瘤微环境响应的双基因敲除制剂的制备方法，其特征在于：所述钯纳米簇BPd的制备：采用生物矿化法制备钯纳米簇，具体制备方法：将0.01M氯钯酸溶液加入到20mg mL-1的牛血清蛋白溶液中，搅拌2min后加入1M氢氧化钠，并在37℃下搅拌反应12h，制得牛血清蛋白矿化的钯纳米簇BPd溶液。
8.根据权利要求7所述的肿瘤微环境响应的双基因敲除制剂的制备方法，其特征在于：CRISPR/Cas9基因编辑系统，通过敲除肿瘤细胞内CD47和APMAP基因表达，降低CD47和APMAP蛋白水平，抑制肿瘤细胞免疫逃逸，提高巨噬细胞吞噬功能。
9.权利要求1所述肿瘤微环境响应型双基因敲除制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.权利要求1所述肿瘤微环境响应的双基因敲除制剂与抗肿瘤前药进行联用在制备抗肿瘤药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种肿瘤微环境响应的双基因敲除制剂，其特征在于：所述肿瘤微环境响应的双基因敲除制剂由crispr/cas9双基因编辑系统、免疫调节剂和肿瘤靶向修饰层组成，并可以与抗肿瘤前药进行联用。
2.根据权利要求1所述的肿瘤微环境响应的双基因敲除制剂，其特征在于：crispr/cas9基因敲除系统由cas9蛋白与两段向导rna复合而成，其中一段sgrna为cd47蛋白基因序列，另一段sgrna为脂肪细胞膜关联蛋白apmap基因序列。
3.根据权利要求1所述的肿瘤微环境响应的双基因敲除制剂，其特征在于：所述免疫调节剂为过渡金属纳米簇，所述过渡金属纳米簇包括金纳米簇、铂纳米簇、钯纳米簇或钌纳米簇中的一种或几种的组合，通过生物矿化的方式进行制备，尺寸小于5.5nm，可通过肾脏代谢，减少金属在体内的累积，降低毒副作用；所述肿瘤靶向修饰层由具有肿瘤靶向性的功能材料构成，所述具有肿瘤靶向性的功能材料包括透明质酸、plga、peg、rdg靶向肽、整合素受体或细胞膜中的任意一种，修饰在纳米粒子表面，实现肿瘤部位特异性富集；所述免疫调节剂通过肿瘤微环境响应性功能分子进行连接，所述肿瘤微环境响应性功能分子包括活性氧响应性功能分子、乏氧响应性功能分子或谷胱甘肽响应性功能分子中的任意一种。
4.根据权利要求2所述的肿瘤微环境响应的双基因敲除制剂，其特征在于：crispr/cas9双基因编辑系统的建立：在ph为7.4的tris-hcl缓冲液中，以1:3的cas9:sgrna质量比将cas9蛋白与sgrna在37℃下孵育10分钟，以形成cas9/sgrna复合物；其中，目标基因为cd47和apmap，...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯淑君，高彦峰，宋玉君，王严裔，刘玉塔，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
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