【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子肽设计领域，具体涉及一种高酯键形成效率的catcher/tag共价连接体。
技术介绍
1、在2014年，edward n. baker等人发现了thr-gln之间形成异肽键ig样蛋白，并进行了结构解析，其晶体结构的pdb id为4ni6；该团队于2017年在4ni6的基础上，将其分离为catcher和tag。在偏酸性环境下，catcher的thr11和tag的gln14可以形成共价键（酯键），但是需要在体系中加入甘油和cacl2，与普通的分子肽对不同的是，将环境的ph调成8.0，并将甘油和ca2+透析出去后，酯键可以被水解。这将被应用在蛋白分离等领域。但是其共价键形成效率不高，影响了其拓展应用。
2、申请人的前期研究成果，中国专利cn 116284278 a公开了一种高酯键形成效率的分子肽突变体ebcatcher，可以提供与ebtag的结合效率。尽管其结合效率较高，但是速度较慢，不能满足某些应用的需要。
技术实现思路
1、针对上述现有技术中存在的问题，本专利技术利用理性设计，在ebcatcher/ebtag的基础上改造得到突变体，形成reversecatcher/reversetag连接体，可以快速、高效形成酯键。
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下的技术方案：
3、一种高酯键形成效率的肽连接体，包括结合配偶体（reversecatcher）和肽标签（reversetag），所述结合配偶体的氨基酸序列如seq id no：1
4、所述seq id no：1的结合配偶体（reversecatcher）的氨基酸序列为tipevkegtlkttvaadgvngssekealvsyenskdgvdvkdtidykdlvpnekynltgklmhvkddgsleevatkttevtavengsgqweldfgnqklqvgekyvvferaesvedlidtdnnye。
5、所述seq id no：2的肽标签（reversetag）的氨基酸序列为dtkqvvkhedkndkaqtlivekpnr。
6、本专利技术的另一目的在于提供所述肽连接体的纯化方法，包括：
7、（1）将reversetag-gfp和reversecatcher-gfp克隆在载体上得到重组质粒，重组质粒导入宿主菌；
8、（2）将带有重组质粒的宿主菌培养至od600=0.6~0.8，之后加入iptg诱导；
9、（3）诱导结束后，菌液离心后收集细胞，加入pbs，超声破碎；
10、（4）将破碎液离心收集上清液，纯化透析获取纯化蛋白。
11、优选的，步骤（1）中所述的载体为pet-22b。
12、优选的，载体的酶切位点为 ndei和 xhoi。
13、优选的，步骤（1）中宿主菌为大肠杆菌 e. colibl21(de3)。
14、优选的，步骤（2）中，带有重组质粒的宿主菌在lb培养基中培养。
15、优选的，步骤（2）中的诱导条件为20℃诱导12~14h，iptg终浓度为0.5~1mm。
16、优选的，步骤（3）中的离心条件为12000rpm离心3~5min。
17、优选的，步骤（3）中所述的超声破碎条件为300~400w，破碎10~15min。
18、优选的，步骤（4）中所述的纯化为在ni-nta树脂中进行。
19、优选的，步骤（4）中纯化后的蛋白在4000 da的透析袋中透析12h以上。
20、本专利技术的又一目的在于提供所述肽连接体在蛋白质分离中的应用。
21、优选的，所述应用包括如下步骤：
22、（1-1）在结合配偶体（reversecatcher）的n-端通过linker连接一个半胱氨酸cys残基，得到cys-reversecatcher；
23、（1-2）将目标蛋白质的n-端连接reversetag，得到reversetag-目标蛋白；
24、（1-3）将所述cys-reversecatcher与巯基蛋白琼脂糖偶联树脂在耦合缓冲液中孵育，之后用cys进行封闭处理，得到cys-reversecatcher结合的树脂；
25、（1-4）将所述reversetag-目标蛋白、所述cys-reversecatcher结合的树脂在酯键反应液中孵育，得到结合树脂，之后去除残留的酯键反应液；所述酯键反应液中含有甘油和cacl2；
26、（1-5）将所述结合树脂在酯键水解液中孵育，使酯键水解，接收目标蛋白。
27、优选的，所述seq id no：3的linker的氨基酸序列为ggggsggggsggggsggggsggggsggggs。
28、优选的，步骤（1-3）中所述的耦合缓冲液为50 mm tris，5 mm edta-na，ph 8.5。
29、优选的，步骤（1-3）中所述孵育的温度为室温，时间为20~30 min。在此过程中，cys会和耦合树脂的碘乙酸基团自发形成硫醚键；
30、优选的，步骤（1-3）中所述的封闭处理为：用cys孵育20~30 min。在这个过程中，cys结合掉未反应的碘乙酸基团。
31、优选的，步骤（1-3）还包括清洗cys-reversecatcher结合的树脂的步骤，所述清洗cys-reversecatcher结合的树脂的方法为：用10 mm ph 7.2的pbs冲洗。
32、优选的，步骤（1-4）中所述的酯键反应液的配方为：100 mm hepes，20%甘油，100 µm cacl2。
33、优选的，步骤（1-4）中所述的孵育的温度为室温，时间为10~20 min。
34、优选的，步骤（1-5）中所述的酯键水解液为10 mm tris，ph 8.0。
35、优选的，步骤（1-5）中所述的孵育的温度为室温，时间为20~30 min。
36、本专利技术的有益效果在于：
37、1. 本专利技术提供的肽连接体，其reversetag和reversecatcher有着非常高的共价结合效率，且结合达到100%的速度很快，在170 s内即可完成；
38、2. 利用本专利技术提供的肽连接体进行蛋白纯化，不需要高浓度的咪唑进行洗脱，故不需要进行透析除盐，更方便。
39、3. 本专利技术提供的蛋白纯化方法，通过cys和reversecatcher之间引入30个氨基酸的linker可以避免reversecatcher在结合到树脂上后，构象被束缚不能和reversetag结合的问题。
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1. 一种高酯键形成效率的Catcher/Tag肽连接体，其特征在于，包括结合配偶体和肽标签，所述结合配偶体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述肽标签的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。
2.权利要求1所述Catcher/Tag肽连接体的纯化方法，其特征在于，包括：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的载体为pET-22b。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，载体的酶切位点为Nde I和Xho I。
5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中宿主菌为大肠杆菌E. coliBL21(DE3)。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（4）中所述的纯化为在Ni-NTA树脂中进行。
7. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（4）中纯化后的蛋白在4000 Da的透析袋中透析12h以上。
8.权利要求1所述Catcher/Tag肽连接体在蛋白质分离中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下步
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述Linker的氨基酸序列为SEQ ID NO：3。
...【技术特征摘要】
1. 一种高酯键形成效率的catcher/tag肽连接体，其特征在于，包括结合配偶体和肽标签，所述结合配偶体的氨基酸序列如seq id no：1所示，所述肽标签的氨基酸序列如seqid no：2所示。
2.权利要求1所述catcher/tag肽连接体的纯化方法，其特征在于，包括：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的载体为pet-22b。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，载体的酶切位点为nde i和xho i。
5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中...
【专利技术属性】
技术研发人员：江凌，陈耀，施旖，李闯，刘伟，朱丽英，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：
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