本发明专利技术属于动物传染病基因工程技术领域。公开了一种利用ＲＶ３８７２、ＥＳＡＴ６和ＣＦＰ１０三基因融合蛋白制备的检测牛结核抗体的免疫胶体金试纸条及制备方法与应用。以融合蛋白作为胶体金标记抗原和硝酸纤维素膜上检测区的捕获抗原建立胶体金免疫层析试纸条。本发明专利技术试剂条对牛结核抗体的检测具有特异性强和灵敏度高的突出优点，能同时鉴别检测卡介苗免疫和非结核分枝杆菌感染。本发明专利技术包括一种重组大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ?ｃｏｌｉ）ＢＬ２１／ｐＥＴ２８ａ－ＭＰＢｒｃｅ，该菌株表达牛分枝杆菌ＲＣＥ蛋白，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为ＣＣＴＣＣ?ＮＯ：Ｍ２０８２４４。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及动物细菌学与动物传染病学
具体地说，是一种借助胶体金 标记显色的免疫层析反应，快速、鉴别检测牛结核抗体的免疫胶体金试纸条及其制备方法。
技术介绍
牛结核病是一种由牛分枝杆菌引起的慢性消耗性人兽共患病，被国际动物卫生组 织(OIE)定的必须通报的疾病之一。2001年和2002年的部分统计结果表明我国个别省市 奶牛结核病阳性率高达10%以上。牛结核病的防制措施是“检疫-扑杀”，即采用牛提纯结 核菌素(PPD)变态反应进行检疫，对检出的阳性牛进行扑杀。皮内变态反应的基本过程是 剃毛、量皮厚、注射结核菌素、72小时后再量皮厚。该方法具有较多缺陷，如牛结核菌素成 分复杂，与环境分枝杆菌和卡介苗具有共同成份而使变态反应出现非特异性反应；感染后 期的敏感性降低；结果判断主观性强；操作复杂，劳动强度大，需要时间长等，这些均使我 国“检疫-扑杀”政策的实施效果大打折扣；此外，皮试反应只能进行活体现场检测，不能 保存样品并进行回顾性分析。除牛外，其它动物的皮试反应未进行过标准化。野生动物因 为难以捕捉，很难进行皮试反应。因此，临床上需要一种适合于不同动物、操作简便、能鉴别 卡介苗免疫和环境分枝杆菌感染的灵敏特异的检测方法。胶体金试纸条就是一种被认为适 合于“栏圈旁”检测的简易方法。该方法是20世纪80年代发展起来的一项新的免疫分析 方法，是应用胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫 标记技术。它具有简便，快速，特异性强，灵敏度高，费用低的优点。依据胶体金免疫层析技 术，在国内外无论人医应用方面，还是兽医应用方面，都已经研制出了多种胶体金免疫层析 快速检测试纸条。由于牛结核感染过程中抗体产生较晚，且不同时期出现针对不同蛋白的抗体，因 此，针对单个蛋白设计的抗体检测方法虽然简便但灵敏度不高。各个科学家都在通过同时 应用多种诊断抗原以提高灵敏度，这种方法被称为“鸡尾酒”法(Siguo Liu, Sheping Guo, Chunlai Wang, Meili Shao, Xiuhua Zhang, YangGuo and Qiang Gong. A novel fusion protein-based indirect enzyme-linked immunosorbent assay forthe detection of bovine tuberculosis. Tuberculosis, 2006, 3 ；C. Aagaard, Μ. Govaerts, V. Meikle, A. J. Vallecillo, J. A. Gutierrez-Pabello, F. Suarez-Giiemes, . McNair, A. Cataldi, C. Espitia, P.Andersen, and J.M. Pollock, Optimizing Antigen Cocktails for Detection of Mycobacterium bovisin Herds with Different Prevalences of Bovine Tuberculosis :ESAT6_CFP10 Mixture Shows OptimalSensitivity and Specificity, ,Clin Microbiol,2006,44(12) 4326-4335 ；Cockle PJ, GordonSV, Hewinson RG, Vordermeier HM. Field evaluation of a novel differential diagnostic reagentfor detection of Mycobacterium bovis in cattle. Clin Vaccine Immunol,2006, 13(10) 1119-1124 ； Kanaujia GV, Garcia MA, Bouley DM, et al. Detection of earlysecretory antigenic target-6 antibodyfor diagnosis of tuberculosis in non-human primates , Comp Med 2003,53(6) =602-606) 本课题组前期研究中，进行了多种牛分枝 杆菌特异性抗原蛋白的融合表达，最后发现，RV3872、CFP10、ESAT6的融合蛋白作用牛结核 诊断抗原具有灵敏度高、特异性好、可区别卡介苗免疫与非结核分枝杆菌的干扰。Rv3872和CFP10及ESAT6蛋白同属牛分枝杆菌的差异基因区(RDl区)，是 ESAT6-CFP10复合体转运系统中的关键因子，敲除Rv3872会中止复合体的合成与分泌， 可能参与了复合体的合成、分泌过程(Priscille Brodin, Laleh Majlessi, Laurent Marsollier, Marien I. de Jonge, Daria Bottai, Caroline Demangel, Jason Hinds, Olivier Neyrolles, Philip D. Butcher, Claude Leclerc, Stewart T.Cole, and Roland Brosch, Dissection of ESAT—6 System 1 of Mycobacterium tuberculosis and Impact on Immunogenicity and Virulence. Infection and Immunity,2006,74(1) :88_98)。有 研究证明结核分枝杆菌的Rv3872能诱导结核病人产生显著的抗体反应(P.Mukherjee， Μ. Dutta, P. Datta, A. Dasgupta, R. Pradhan, Μ. Pradhan, Μ. Kundu, J. Basu andP. Chakrabarti, The RDl-encoded antigen Rv3872 of Mycobacterium tuberculosis as a potential candidate forserodiagnosis of tuberculosis. Clinical Microbiology and Infection, 2007，13 (2) 146-152)，鉴于牛分枝杆菌与结核分枝杆菌在基因组水平上 有99. 95%的同源性，提示该蛋白可能具有应用于牛结核血清学诊断的潜力。申请者的前期工作即授权专利(专利号ZL 2006101665510 ；专利技术名称检测牛结 核抗体的免疫胶体金试纸条，授权公告日2009年6月3日)也是一种牛结核抗体检测方 法，但该方法不具备鉴别诊断功能，不能区分卡介苗和非结核分枝杆菌感染，而本专利技术是针 对毒力型牛分枝杆菌的特异性早期分泌蛋白设计的免疫胶体金试纸条，除了具上已授权专 利的灵敏度与特异性外，还具有鉴别诊断的新功能。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术的不足，提供一种一种应用Rv3872新型融合蛋白 制备的牛结核抗体鉴别检测本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种牛结核抗体的检测试纸条，其包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和ＰＶＣ背衬，其特征在于，在ＰＶＣ背衬（７）上按顺序依次粘附有样品垫（１）、结合垫（２）、硝酸纤维素膜（３）、吸水垫（４）；所述的结合垫（２）上包被有保藏号为ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｍ２０８２４４的重组大肠杆菌所表达的Ｒｖ３８７２－ＣＦＰ１０－ＥＳＡＴ６蛋白与胶体金的标记物；所述的硝酸纤维素膜（３）上分别包被有Ｒｖ３８７２－ＣＦＰ１０－ＥＳＡＴ６蛋白的检测线（５）、抗Ｒｖ３８７２－ＣＦＰ１０－ＥＳＡＴ６蛋白ＩｇＧ构成的质控线（６）；其中，Ｒｖ３８７２－ＣＦＰ１０－ＥＳＡＴ６蛋白是以牛分支杆菌全基因组为模板克隆Ｒｖ３８７２、ＣＦＰ１０和ＥＳＡＴ６基因，构建三种基因融合表达的原核表达载体，并在大肠杆菌中表达得到。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭爱珍，于清龙，刘冬光，涂玲玲，陈颖钰，廖娟红，凌洁玉，陈焕春，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83
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