【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及肝脏免疫学。更具体地，本专利技术涉及由嵌合抗原受体及其修饰的免疫细胞，和免疫性肝炎及肝纤维化的动物模型的建立方法。
技术介绍
1、近年来，包括细胞治疗和免疫检查点抑制剂等免疫治疗在多种恶性肿瘤取得了突破性进展。免疫治疗增强自身免疫系统识别、攻击异种细胞和病原体，同时也可能攻击自身正常细胞而造成免疫性组织损伤，免疫性肝炎就是其中之一。随着免疫治疗的推广，免疫性肝炎及肝纤维化的检出率不断升高，是导致肝脏功能衰竭、肝硬化等的重要病因。由于其确切的病理机制仍不清楚，目前的治疗方案十分有限，导致这种研究窘境的主要一个原因就是免疫治疗相关肝炎及肝纤维化模型的缺乏。
2、目前已报道的肝炎及肝纤维化模型包括刀豆蛋白(concanavalin a)诱导的肝炎模型，半乳糖胺/脂多糖联合诱导肝损伤，小鼠巨细胞病毒和丙型肝炎病毒感染诱导肝炎模型，这些模型并不能代表免疫治疗后免疫性肝炎及肝纤维化的发生发展进程。已有报道使用免疫检查点ctla4抑制剂和/或ido抑制剂在pdcd-/-小鼠上诱导免疫性肝炎模型，然而该模型用药时间久，且该模型诱导的免疫性肝炎为轻症，并无显著肝损伤以及肝纤维化的病理表现，无法模拟临床真实情况下严重免疫性肝炎及肝纤维化的病理生理过程。
3、嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,car)修饰免疫细胞过继疗法已成为治疗血液恶性肿瘤的有效方法，目前正在开发用于治疗实体肿瘤。car作为一种人工重组受体，通常由位于胞外段的抗原识别结构域、跨膜区、胞内激活信号结构域组成。car
4、因此，为了更好、更方便地研究免疫性肝损伤的病理生理发展及机制，以及筛选有效地缓解肝损伤的药物及疗效观察研究，有必要建立一种方便快捷且有效模拟人类疾病发病机制、病程特点的免疫性肝炎及肝纤维化模型。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种在免疫健全动物上使用嵌合抗原受体诱导建立免疫性肝损伤模型的技术。
2、本专利技术为了解决技术问题，提供了一种嵌合抗原受体。该嵌合抗原受体包括胞外抗原结合结构域，跨膜结构域，胞内共刺激结构域和信号转导结构域；所述的胞外抗原结合结构域是能与抗原结合的抗体的重链可变区；所述的抗原为表皮生长因子受体egfr。
3、其中，上述嵌合抗原受体中所述的与抗原结合的抗体为单克隆抗体、多克隆抗体或者纳米抗体。
4、其中，上述嵌合抗原受体中所述的抗原为实验动物的egfr。进一步的，所述的实验动物为：小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔、犬、猫、猪、羊或猴中的至少一种。
5、优选的，所述的实验动物为小鼠；进一步的，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列为seq id no.3所示。
6、其中，上述嵌合抗原受体中所述的跨膜结构域是与cd28、cd8、cd3ζ、cd134、cd137、icos、dap10或cd27蛋白的跨膜区氨基酸序列同源性90％以上的蛋白结构域。优选地，所述跨膜结构域是cd8a蛋白的跨膜白结构域。进一步的，所述跨膜结构域的氨基酸序列如seqid no.7所示。
7、其中，上述嵌合抗原受体中所述的胞内共刺激结构域是与cd28、ox40、cd27、cd2、cd5、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、4-1bbl和4-1bb胞内共刺激结构域序列同源性90％以上的蛋白结构域。优选地，所述胞内共刺激结构域是cd28蛋白共刺激结构域。进一步的，所述胞内共刺激结构域的氨基酸序列如seq id no.9所示。
8、其中，上述嵌合抗原受体中所述的信号转导结构域是cd3ζ结构域。进一步的，信号转导结构域的氨基酸序列如seq id no.11所示。
9、其中，上述嵌合抗原受体的氮端还联有信号肽。优选的，所述信号肽为cd8信号肽(cd8a sp)。进一步的，所述信号肽的氨基酸序列为seq id no.1所示。
10、进一步的，上述的嵌合抗原受体中，各结构域可用铰链区(hinge)连接。胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间可用铰链区(hinge)连接，进一步的，所述的铰链区(hinge)的氨基酸序列如seq id no.5所示。
11、优选的，上述嵌合抗原受体依次由cd8信号肽(cd8a sp)、egfr抗体的重链可变区vh(egfr vh)、铰链区(hinge)、cd8a跨膜区(cd8a tm)、cd28胞内域(cd28 intra)和cd3ζ结构域构成。更进一步的，上述嵌合抗原受体的氨基酸序列如seq id no.13所示。
12、本专利技术还提供了上述嵌合抗原受体的编码基因。进一步的，上述编码基因的核苷酸序列为seq id no.14所示。
13、本专利技术还提供了一种重组质粒。该重组质粒包括编码上述嵌合抗原受体的编码基因。
14、本专利技术同时也提供了一种重组病毒。该重组病毒能表达上述的嵌合抗原受体。进一步的，所述的病毒为：用于携带或制备嵌合抗原受体以修饰免疫细胞的慢病毒、腺病毒或逆转录病毒。
15、本专利技术也提供了一种嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。该免疫细胞含有上述的嵌合抗原受体。进一步的，所述免疫细胞为t细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞或肿瘤浸润淋巴细胞中的至少一种。优选的，所述免疫细胞为t细胞。
16、本专利技术还提供了上述的嵌合抗原受体、上述的重组质粒、上述的重组病毒或上述的免疫细胞在制备免疫性肝炎和/或肝纤维化动物模型中的用途。其中，所述动物为小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔、犬、猫、猪、羊或猴中的至少一种。进一步的，所述动物为免疫健全动物。优选的，所述的动物为小鼠。
17、本专利技术也还提供了一种免疫性肝炎和/或肝纤维化模型的建立方法。该方法时上述述的嵌合抗原受体、上述的重组质粒、上述的的重组病毒或者上述免疫细胞中的至少一种作为造模试剂，用造模试剂输入实验动物体内以诱导实验动物成为免疫性肝炎和/或肝纤维化模型。其中，所述动物为小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔、犬、猫、猪、羊或猴中的至少一种。进一步的，所述的实验动物为免疫健全动物。优选的，所述的动物为免疫健全小鼠。一般使用balb/c或c57bl/6j小鼠。
18、所述模型建立的的标准为模型动物的谷丙转氨酶水平和/或谷草转氨酶水平升高，或者出现肝脏特征性免疫性病理损伤表现中本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.嵌合抗原受体，其特征在于：包括胞外抗原结合结构域，跨膜结构域，胞内共刺激结构域和信号转导结构域；所述的胞外抗原结合结构域是能与抗原结合的抗体的重链可变区；所述的抗原为表皮生长因子受体EGFR。
2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的抗原为小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔、犬、猫、猪、羊或猴的表皮生长因子受体；进一步的，所述的与抗原结合的抗体为单克隆抗体、多克隆抗体或者纳米抗体；更进一步，所述的抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。
3.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述的跨膜结构域是与CD28、CD8、CD3ζ、CD134、CD137、ICOS、DAP10或CD27蛋白的跨膜区氨基酸序列同源性90％以上的蛋白结构域；优选地，所述跨膜结构域是CD8a蛋白的跨膜区结构域；更进一步，所述的跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
4.如权利要求1～3任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述胞内共刺激结构域是与CD28、OX40、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a
5.如权利要求1～4任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述信号转导结构域是CD3ζ结构域；进一步的，所述信号转导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
6.如权利要求1～5任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体的氮端还连有信号肽；优选的，所述信号肽为CD8信号肽；进一步的，所述信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
7.如权利要求1～6任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述的嵌合抗原受体中，还有铰链区；进一步的，所述铰链区连接胞外抗原结合结构域和跨膜结构域；进一步的，所述的铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
8.如权利要求1～7任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体依次由CD8信号肽(CD8a SP)、EGFR抗体的重链可变区VH(EGFR VH)、铰链区(Hinge)、CD8a跨膜区(CD8a TM)、CD28胞内域(CD28 intra)和CD3ζ结构域构成。
9.如权利要求1～8任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于氨基酸序列如SEQ IDNO.13所示。
10.一种重组质粒，其特征在于其包括编码权利要求1～9任一项所述的嵌合抗原受体的基因。
11.如权利要求10所述的重组质粒，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示。
12.一种重组病毒，其特征在于：所述重组病毒能表达权利要求1～9任一项所述嵌合抗原受体所述的嵌合抗原受体；进一步的，所述的病毒为：用于携带或制备嵌合抗原受体以修饰免疫细胞的慢病毒、腺病毒或逆转录病毒。
13.一种嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于：所述免疫细胞含有权利要求1～9任一项所述嵌合抗原受体。
14.如权利要求11所述的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于：所述免疫细胞为T细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞或肿瘤浸润淋巴细胞中的至少一种；优选的，所述免疫细胞为T细胞。
15.权利要求1～9任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求10或11所述的重组质粒、权利要求12所述的重组病毒或权利要求13～14任一所述的免疫细胞在诱导免疫性肝炎和/或肝纤维化动物模型中的用途；进一步的，所述动物为免疫健全动物；更进一步的，所述的动物为小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔、犬、猫、猪、羊或猴中的至少一种。
16.如权利要求14所述中的用途，其特征在于：所述动物模型具有谷丙转氨酶水平和/或谷草转氨酶水平升高，或者出现肝脏特征性免疫性病理损伤表现中的至少一项。
17.免疫性肝炎和/或肝纤维化模型的建立方法，其特征在于：使用权利要求1～9任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求10或11所述的重组质粒、权利要求12所述的重组病毒或者权利要求13～14任一所述的免疫细胞中的至少一种作为造模试剂，用造模试剂输入实验动物体内以诱导实验动物成为免疫性肝炎和/或肝纤维化模型；进一步的，所述的实验动物为为免疫健全动物；更进一步的，所述的动物为小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔、犬、猫、猪、羊或猴中的至少一种。
18.权利要求17所述的方法所建立的免疫性肝炎和/或肝纤维化模型在以下任一项中的应用：<...
【技术特征摘要】
1.嵌合抗原受体，其特征在于：包括胞外抗原结合结构域，跨膜结构域，胞内共刺激结构域和信号转导结构域；所述的胞外抗原结合结构域是能与抗原结合的抗体的重链可变区；所述的抗原为表皮生长因子受体egfr。
2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的抗原为小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔、犬、猫、猪、羊或猴的表皮生长因子受体；进一步的，所述的与抗原结合的抗体为单克隆抗体、多克隆抗体或者纳米抗体；更进一步，所述的抗体的重链可变区的氨基酸序列为seq id no.3所示。
3.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述的跨膜结构域是与cd28、cd8、cd3ζ、cd134、cd137、icos、dap10或cd27蛋白的跨膜区氨基酸序列同源性90％以上的蛋白结构域；优选地，所述跨膜结构域是cd8a蛋白的跨膜区结构域；更进一步，所述的跨膜结构域的氨基酸序列如seq id no.7所示。
4.如权利要求1～3任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述胞内共刺激结构域是与cd28、ox40、cd27、cd2、cd5、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、4-1bbl和4-1bb胞内共刺激结构域序列同源性90％以上的蛋白结构域；优选地，所述胞内共刺激结构域是cd28蛋白共刺激结构域；进一步的所述胞内共刺激结构域的氨基酸序列如seq id no.9所示。
5.如权利要求1～4任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述信号转导结构域是cd3ζ结构域；进一步的，所述信号转导结构域的氨基酸序列如seq id no.11所示。
6.如权利要求1～5任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体的氮端还连有信号肽；优选的，所述信号肽为cd8信号肽；进一步的，所述信号肽的氨基酸序列为seq id no.1所示。
7.如权利要求1～6任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述的嵌合抗原受体中，还有铰链区；进一步的，所述铰链区连接胞外抗原结合结构域和跨膜结构域；进一步的，所述的铰链区的氨基酸序列如seq id no.5所示。
8.如权利要求1～7任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体依次由cd8信号肽(cd8a sp)、egfr抗体的重链可变区vh(egfr vh)、铰链...
【专利技术属性】
技术研发人员：王永生，刘宁，张本霞，李丹，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：
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