【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物保护，具体地，涉及一种杂交瘤细胞株2g2b12及利用其产生的单克隆抗体检测水稻种子中水稻条斑病菌活菌体的方法。
技术介绍
1、水稻条斑病是水稻生产上的重要病害之一，由稻黄单胞菌稻生致病变种(xanthomonas oryzae pv.oryzicola)引起，属我国农业植物检疫性有害生物，也被世界许多水稻生产国列为植物检疫性有害生物。本世纪以来，由于水稻种子频繁调运、杂交籼稻特别是两系杂交籼稻大面积种植、轻减化栽培方式推广、台风暴雨等异常天气频发，导致水稻条斑病在长江以南稻区持续危害，并扩展到淮河流域。常年发生为害面积1000万亩以上，主要为害籼稻，尤其是杂交籼稻，通常造成水稻产量损失5％-15％，严重时达50％以上，是我国稻米安全生产的重要隐患之一。
2、条斑病菌主要在水稻种子和病稻草上越冬，并成为来年病害发生的主要初侵染源。种子带菌是病害长距离传播扩散的主要途径。种子检疫和药剂处理是阻断条斑病菌长距离传播和减轻病害发生为害的有效措施之一，这依赖于精准、灵敏的种子带菌检测技术。目前已建立了多种种子带菌检测技术，如pcr检测、lamp检测、实时荧光定量pcr检测、酶联免疫吸附检测(elisa)等，但是，这些技术不能区分水稻种子中的活菌和死菌；而选择性培养基分离培养、pma-pcr检测等方法可以检测种子上的活菌，但检测灵敏度不高，易受非目的细菌(杂菌)干扰，或者操作较为复杂，难以实现定量检测。此外，在不良环境条件下，条斑病菌可以进入一种存活但不可培养状态(viable but non-culturab
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种杂交瘤细胞株2g2b12及利用其产生的单克隆抗体检测水稻种子中水稻条斑病菌活菌体的方法，所述方法能够方便快捷的定量检测水稻种子中的水稻条斑病菌，且能够区分活菌和死菌。
2、本专利技术的目的可通过如下技术方案实现：
3、本专利技术的第一方面提供一种杂交瘤细胞株2g2b12，已于2023年3月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址：中国，武汉市，武汉大学；保藏编号：cctcc no:c202354；拉丁名：hybridoma cell line 2g2b12。
4、本专利技术第二方面提供本专利技术所述杂交瘤细胞株2g2b12产生的抗水稻条斑病菌单克隆抗体。
5、本专利技术第三专利技术提供所述的杂交瘤细胞株2g2b12及单克隆抗体在检测水稻条斑病菌中的应用。
6、更具体的，是提供所述的杂交瘤细胞株2g2b12及单克隆抗体在检测水稻种子中水稻条斑病菌中的应用。
7、更具体的，是提供所述的杂交瘤细胞株2g2b12及单克隆抗体在检测水稻条斑病菌活菌体中的应用。
8、更具体的，是提供所述的杂交瘤细胞株2g2b12及单克隆抗体在检测水稻种子中水稻条斑病菌活菌体中的应用。
9、更具体的，是提供所述的杂交瘤细胞株2g2b12及单克隆抗体在检测处于vbnc状态的水稻条斑病菌活菌体中的应用。
10、更具体的，是提供所述的杂交瘤细胞株2g2b12及单克隆抗体在检测水稻种子中处于vbnc状态的水稻条斑病菌活菌体中的应用。
11、本专利技术所述的杂交瘤细胞株2g2b12和单克隆抗体，是通过以下方法制备得到：
12、(1)免疫原的制备：按照常规方法，将水稻条斑病菌rs105、xoc-m和xoc-w分别在na(蔗糖10g/l、蛋白胨5g/l、酵母粉1g/l、牛肉浸膏3g/l、琼脂粉16g/l，ph 6.8-7.0，121℃灭菌15min)营养琼脂平板上培养36-48h，利用无菌玻棒刮下菌苔，用0.9％的灭菌生理盐水充分悬浮菌体，离心收集沉淀，再悬浮洗涤2-3次，最后充分悬浮菌体，转入无菌透析袋中，于2％的戊二醛中固定3-4h，然后在无菌去离子水中透析洗涤60-72h(每6h换1次水)，离心收集菌体，将3种菌体等量混匀，用无菌水悬浮菌体并调整菌体密度约5.0×109cfu/ml-2.0×1010cfu/ml，即为免疫原，保存在-20℃备用。
13、(2)单克隆抗体的制备：按照常规方法，取上述制备的免疫原500μl与等体积弗氏完全佐剂混合，充分乳化后，注射6-8周龄健康balb/c雌性小鼠，每只小鼠腹腔注射200μl；2-3周后，按照上述方法利用弗氏不完全佐剂进行混合乳化免疫原，然后再次注射小鼠，以后间隔2-3周免疫1次，共计免疫5次；最后每只小鼠直接注射200μl免疫原加强免疫，3天后在无菌条件下取小鼠脾脏并制备脾细胞，将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞sp2/0进行融合；待杂交瘤细胞长到每孔200个以上，取培养上清液，利用间接竞争elisa法筛选出效价高、反应特异、细胞生长能力强的杂交瘤细胞，按有限稀释法亚克隆3-4次，获得单克隆杂交瘤细胞株2g2b12；对获得的单克隆杂交瘤细胞株进行分泌稳定性测定、腹水抗体制备和效价测定等，最后通过辛酸-硫酸铵沉淀法纯化制备抗水稻条斑病菌单克隆抗体。
14、本专利技术所述的杂交瘤细胞株2g2b12及其产生的单克隆抗体在检测水稻种子中水稻条斑病菌活菌体中的应用，可以采用本领域常用的方法，例如可以做成免疫试纸条便于操作，也可采用免疫吸附分离方法。
15、在一种实施例中，本专利技术提供一种具体的检测水稻种子中水稻条斑病菌活菌体的方法：
16、(1)向灭菌干锅加入待检测水稻种子5-10g，碾磨碎，然后添加适量无菌水，浸泡20-30min，得到待测水稻种子样品浸泡液；
17、(2)向24孔细胞培养板中加入本专利技术所述的抗水稻条斑病菌单克隆抗体1:2000-1:8000稀释包被液，30-37℃下孵育1-2h或4℃孵育过夜，同时设置健康小鼠血清和仅有包被缓冲液为对照；
18、(3)用rt洗脱液洗3-4次，每次3-5min；
19、(4)用rtp封闭液封闭细胞培养板，每孔500μl，30-37℃下孵育1-2h；
20、(5)吸去rtp封闭液，每孔加入步骤(1)的待测水稻种子样品浸泡液，30-37℃下孵育1-3h或4℃孵育过夜；
21、(6)用rt洗脱液洗涤4-5次，每次3-5min，然后用无菌吸水纸吸干微孔内液体；
22、(7)向上述步骤(6)处理好的细胞培养板加入融化并冷却至45℃的na培养基，加盖后置于28℃培养48-60h；统计每孔长出的单菌落数量，进一步统计每克种子携带的水稻条斑病菌可培养活菌数。
23、在另一种实施例中，本专利技术还提供水稻种子中水稻条斑病菌vbnc状态活菌体的检测方法：
24、(1)复苏培养基的制备：将水稻条斑病菌发酵液无菌上清与融化的na液态培养基等体积混合，即为复苏培本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种杂交瘤细胞株2G2B12，保藏编号为CCTCC NO:C202354。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株2G2B12产生的抗体。
3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株2G2B12或权利要求2所述的抗体在检测水稻条斑病菌中的应用。
4.权利要求1所述的杂交瘤细胞株2G2B12或权利要求2所述的抗体在检测水稻种子中水稻条斑病菌中的应用。
5.权利要求1所述的杂交瘤细胞株2G2B12或权利要求2所述的抗体在检测水稻条斑病菌活菌体中的应用。
6.权利要求1所述的杂交瘤细胞株2G2B12或权利要求2所述的抗体在检测水稻种子中水稻条斑病菌活菌体中的应用。
7.权利要求1所述的杂交瘤细胞株2G2B12或权利要求2所述的抗体在检测处于VBNC状态的水稻条斑病菌活菌体中的应用。
8.权利要求1所述的杂交瘤细胞株2G2B12或权利要求2所述的抗体在检测水稻种子中处于VBNC状态的水稻条斑病菌活菌体中的应用。
9.一种检测水稻种子中水稻条斑病菌活菌体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
10.
...【技术特征摘要】
1.一种杂交瘤细胞株2g2b12，保藏编号为cctcc no:c202354。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株2g2b12产生的抗体。
3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株2g2b12或权利要求2所述的抗体在检测水稻条斑病菌中的应用。
4.权利要求1所述的杂交瘤细胞株2g2b12或权利要求2所述的抗体在检测水稻种子中水稻条斑病菌中的应用。
5.权利要求1所述的杂交瘤细胞株2g2b12或权利要求2所述的抗体在检测水稻条斑病菌活菌体中的应用。
6.权利要求1所述的杂交瘤细胞株2g...
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