【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于功能酶筛选，涉及一种来源于lachnellula hyalina的酮还原酶及其突变体、编码它们的核酸分子、含有这些核酸分子的载体和细胞，以及它们的制备方法及其在(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯制备中的应用。
技术介绍
1、l-左旋肉碱最初在红色肉类提取物中发现，在人体内主要负责运输长链脂肪酸进入线粒体内发生氧化，广泛的被应用于医药、保健品等领域，目前对左旋肉碱的制备多是依赖于化学合成的方法制备。(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((r)-chbe)是一种重要的手性中间体，可以广泛用于l-左旋肉碱、阿法替尼等手性药物的制备。其经氨化、水解、去离子化，可制备得到l-左旋肉碱及其衍生盐等。以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，经手性催化剂(稀有金属制备的金属催化剂)催化是目前制备(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的主要手段，手性催化剂正被尝试寻求绿色的生物催化、发酵的方法去替代，也是目前最合适被生物酶催化实现l-左旋肉碱制备的方法。
2、使用生物酶催化4-氯乙酰乙酸乙酯制备(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，以酮还原酶催化备受青睐，反应过程中需要添加一定量的还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)作为辅酶参与反应。目前基于生物酶或生物发酵的方式制备(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯尚未进入工业化生产阶段，因此还需要对可催化该反应的生物酶进行进一步的挖掘、发现和改造，以求其可以满足工业化上生产(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的需求。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种酮还
2、本专利技术从lachnellula hyalina菌株中获得酮还原酶kredlh，其氨基酸序列如seqid no:1所示，核苷酸序列如seq id no:2所示，通过进一步对其进行突变处理，获得一种在酶活性、转化率和重复使用稳定性方面得到显著改善的酮还原酶突变体kredlh-m，其氨基酸序列如seq id no:3所示，核苷酸序列如seq id no:4所示。
3、在第一方面，本专利技术提供一种具有seq id no:1所示的氨基酸序列的酮还原酶。
4、本专利技术提供的上述酮还原酶可以人工合成，也可以先合成其编码基因，再进行生物表达，如使用重组技术从大肠杆菌中表达获得。
5、在一些实施方案中，上述酮还原酶是通过将含有其编码基因的重组载体转化导入大肠杆菌表达宿主(例如e.coli bl21(de3))构建的重组基因工程菌株，然后培养该菌株，并添加诱导剂诱导表达得到酮还原酶。
6、在第二方面，本专利技术提供一种编码上述酮还原酶的核酸分子，其具有seq id no:2所示的核苷酸序列。
7、本专利技术提供的上述核酸分子通常可以通过使用pcr仪扩增或人工合成的方法获得。
8、在第三方面，本专利技术提供上述酮还原酶的突变体，其具有seq id no:3所示的氨基酸序列，其催化活力、重复使用稳定性以及转化率与上述酮还原酶相比有进一步提高。本专利技术提供的上述酮还原酶的突变体可人工合成，也可以先合成其编码基因，再进行生物表达得到，如使用重组技术从原核生物(大肠杆菌)中表达获得。
9、在一些实施方案中，上述酮还原酶突变体是通过将含有其编码基因的重组载体转化进入大肠杆菌表达宿主(例如e.coli bl21(de3))构建重组基因工程菌，然后培养该菌株，并添加诱导剂诱导表达得到酮还原酶突变体。
10、在第四方面，本专利技术提供一种编码上述酮还原酶突变体的核酸分子，其具有seqid no:4所示的核苷酸序列。
11、本专利技术提供的上述核酸分子通常可以通过使用pcr仪扩增或人工合成的方法获得。
12、第五方面，本专利技术提供一种重组载体，其包含上述任一所述的核酸分子。
13、在一些实施方案中，上述重组载体为pet-kredlh或pet-δkredlh-m61，分别是将编码上述酮还原酶的核酸分子或上述酮还原酶突变体的核酸分子替换pet-28a(+)的ecori和hindiii酶切位点间序列，其余序列保持不变得到的。
14、在第六方面，本专利技术提供一种重组细胞，其包含上述任一所述的重组载体。
15、在一些实施方案中，所述重组细胞经诱导后表达上述酮还原酶或酮还原酶的突变体。
16、在一些实施方案中，所述重组细胞的构建方法包括如下：
17、将所述重组载体转化到表达宿主细胞中，经培养并添加诱导剂诱导表达，得到表达上述酮还原酶或酮还原酶的突变体。
18、进一步地，所述重组载体为上述任一所述的重组载体，所述表达宿主细胞为原核生物生物细胞或真核生物细胞，例如大肠杆菌、酵母等，优选大肠杆菌表达宿主e.colibl21(de3)。
19、在一些实施方案中，所述重组细胞为重组菌ke和重组菌61，重组细胞可以是重组基因工程菌。重组基因工程菌表达酮还原酶或其突变体时所使用的培养基可以是本领域可以使重组基因工程菌生长并表达本专利技术的酮还原酶或其突变体的培养基，例如tb培养基。
20、培养方法和培养条件没有特殊要求，保证重组基因工程菌株正常生长即可，并于18℃条件下诱导表达酮还原酶及其突变体。
21、更具体地，上述重组细胞的构建方法，包含如下步骤：
22、(1)酮还原酶的基因kredlh扩增；
23、(2)酮还原酶突变体的基因δkredlh-m61的获得；
24、(3)重组表达质粒pet-kredlh和pet-δkredlh-m61的构建；
25、(4)重组表达质粒pet-kredlh和pet-δkredlh-m61转化进入宿主细胞；
26、(5)平板抗性培养基筛选得到阳性克隆菌株；
27、在第七方面，本专利技术提供一种酮还原酶或其突变体的制备方法，包括：
28、对上述任一所述的重组细胞进行培养并加入诱导剂诱导，得到培养物；
29、从所述培养物中分离上述酮还原酶或酮还原酶突变体；
30、其中，对重组细胞进行培养并诱导的方法、将酮还原酶及其突变体从培养物中分离出来的方法均为本领域的常规方法。
31、在第八方面，本专利技术提供上述酮还原酶、上述任一所述的核酸分子、上述酮还原酶的突变体、上述重组载体、上述重组细胞和上述方法制备得到的酮还原酶及其突变体在制备(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，所述(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯可进一步用于左旋肉碱及其衍生盐的制备。
32、在第九方面，本专利技术提供一种(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的制备方法，包括：以上述酮还原酶、上述酮还原酶突变体、上述重组细胞或上述方法制备得到的酮还原酶或其突变体作为催化剂，对4-氯乙酰乙酸乙酯进行催化反应，得到(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
33、在一些实施方案中，上述催化反应中，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种酮还原酶，其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述的酮还原酶的核酸分子，其具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
3.权利要求1所述的酮还原酶的突变体，其具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
4.编码权利要求3所述的酮还原酶的突变体的核酸分子，其具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
5.一种重组载体，其包含权利要求2或4所述的核酸分子。
6.一种重组细胞，其包含权利要求5所述的重组载体。
7.一种酮还原酶或其突变体的制备方法，其包括以下步骤：
8.权利要求1所述的酮还原酶、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的酮还原酶的突变体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的重组载体、权利要求6所述的重组细胞和/或权利要求7所述的方法制备得到的酮还原酶或其突变体在制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。
9.一种(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的制备方法，包括以下步骤：以权利要求1所述的酮还原酶、权利要求3所述的酮还原酶的
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述催化的反应条件为：温度25-35℃，pH 6.0-7.0，所述反应投料包括：4-氯乙酰乙酸乙酯、异丙醇和NADH；
...【技术特征摘要】
1.一种酮还原酶，其具有seq id no:1所示的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述的酮还原酶的核酸分子，其具有seq id no:2所示的核苷酸序列。
3.权利要求1所述的酮还原酶的突变体，其具有seq id no:3所示的氨基酸序列。
4.编码权利要求3所述的酮还原酶的突变体的核酸分子，其具有seq id no:4所示的核苷酸序列。
5.一种重组载体，其包含权利要求2或4所述的核酸分子。
6.一种重组细胞，其包含权利要求5所述的重组载体。
7.一种酮还原酶或其突变体的制备方法，其包括以下步骤：
8.权利要求1所述的酮还原酶、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的酮还...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵伟，姜君鹏，王竞辉，
申请(专利权)人：万华化学集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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