【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，特别涉及一种工程化dna晶体结晶后功能化方法和应用。
技术介绍
1、dna自组装是自然界中最普遍的现象之一：两条互补的单链dna分子自发杂交形成双链dna结构。整个杂交过程由一系列的非共价相互作用驱动，如氢键、范德瓦耳斯力、静电力和疏水相互作用月等，并且严格遵守watson-crick碱基互补配对规则。dna纳米自组装可利用dna分子超强的程序化组装能力，精巧地构筑有序dna超分子结构。
2、最初研究dna自组装的目的是实现晶体结构的人工设计与构造，并以此来实现蛋白质分子的三维有序组装与可控结晶。第一个人工设计的dna三维晶体是基于黏性末端导向组装，该设计可生长出具有宏观尺寸和周期性孔洞结构的dna三维晶体。dna三维晶体生长过程中往往需要较弱的模块间相互作用，但后续表征及应用(尤其是后者)则希望模块间相互作用较强以提高晶体稳定性。
3、dna连接酶是一种能够催化相邻dna的3’-oh和5’-磷酸基末段形成磷酸二酯键，并且把两段dna拼接起来以封闭dna片段之间的间隙的核酸酶。t4 dna连接酶(t4 dnaligase，t4lig)由于在正常条件下，即能完成连接反应，是目前应用比较多的病毒基因组编码的dna连接酶，主要从缺失型嗜菌体中提取。t4lig连接反应机理是基于切口双链dna 底物得到的。利用目前已知的t4lig的连接特点，在具体的操作中，对dna片段的连接方法分为以下三种：连接ds dna的黏性末端、连接平末端、连接人为合成黏性末端。
技术实现思路
1、基于专利技术人课题组先前的研究结果，设计出了三角形张拉结构基元以生长得到具有数百微米尺寸的dna三维晶体，该晶体具有可观的三维结构，且可在dmso中发生皱缩，添加目的中心链可以达到替换中心链的作用。其中，所述三角形张拉结构基元，包括为中心链l链、边链m链、角链s链3种不同的dna组成链，共7条链，边链m链在三个双螺旋方向延伸，具有三次重复序列的中心链l链位于结构基元的中央，每个双螺旋结构的两端各带有2个碱基的粘性末端，其互相作用形成非常有序的3d晶体网络。
2、本专利技术的目的是提供一种工程化dna晶体结晶后功能化的方法和应用。
3、本专利技术提供的工程化的dna三维晶体的制备方法，具体步骤如下：
4、(1)将组成三角形张拉结构基元的三条dna单链按照化学计量比在特定缓冲液中混合(dna单链的最终浓度为4μm)，从95℃逐渐降温(退火)至4℃，形成相应的基元模块；
5、其中，所述三条dna单链分别为中心链l链、边链m链、角链s链，每条s链的两端部分互补配对分别与两条m链的一个末端部分互补配对，互补配对碱基数分别12个或11个；且(1)每条m链和s链粘性末端必须为两个碱基长度；(2)每条m链为42个碱基长度；且从5'端到3'端被分成三段，各段碱基数需为13、17、12；(3)每条l链为三段结构基元序列的重复，并在三角形张拉结构基元的中心分别与三条m链中间部分互补配对，优选地l链与每条m链互补配对的长度为17个碱基；；优选地，m链5’端进行磷酸化修饰，s链的5’端进行磷酸化修饰，方便粘性末端结合。
6、(2)用悬滴蒸气扩散法进行结晶，在温度为30-35℃，结晶溶液体积为5μl，结晶溶液盐浓度为0.5×tae/mg(mgac2)，结晶液池盐浓度为2-5×tae/mg(mgac2)条件下，得到晶形好、分辨率高的晶体；
7、进一步地，还包括：(3)t4dna连接酶加固溶液包括10×tae/mg(mgac2)、10mmatp、t4lig和水，向生长好的晶体液滴中加入5μl加固溶液，过夜即得到加固好的工程化dna晶体；
8、任选还包括：(4)使用1×tae/mg(mgac2)清洗加固过的晶体，每个晶体液滴清洗8-10次以洗去t4 dna连接酶加固溶液中含有的atp、甘油等物质；
9、本专利技术步骤(1)中，所述dna单链的纯化方式优选为hpage，更优选为hplc。
10、本专利技术步骤(1)中，所述dna单链溶解时的溶剂优选为双蒸水。
11、本专利技术步骤(1)中，所述退火步骤优选为95℃、5min，65℃、30min，50℃、30min，37℃、30min，22℃、30min，4℃、30min。
12、本专利技术步骤(1)中，所述dna单链最初使用双蒸水溶解后浓度优选为30-50μm，更优选为30-35μm。
13、本专利技术步骤(2)中，悬滴蒸气扩散法使用的结晶板为hampton公司的24孔结晶板。
14、本专利技术步骤(2)中，结晶液池盐浓度优选为4-5×tae/mg(mgac2)，更优选结晶液池盐浓度为5×tae/mg(mgac2)。
15、本专利技术步骤(3)中，所述t4dna连接酶优选为400-1000u/μl，优选为600u/μl。
16、本专利技术步骤(3)中，t4 dna连接酶加固溶液最终配比优选为每10μl加固溶液含10×tae/mg(mgac2)5.5μl，10mmatp 1μl，t4lig1.34μl，双蒸水2.16μl。
17、本专利技术也提供一种工程化dna晶体，其由三角形张拉结构基元为基础形成非常有序的3d晶体网络，所述三角形张拉结构基元包括为中心链l链、边链m链、角链s链3种不同的dna组成链，三条边链m链在三个双螺旋方向延伸，每个方向由角链连接共形成三个双螺旋结构，具有三次重复序列的中心链l链位于结构基元的中央，每个双螺旋结构的两端各带有2个碱基的粘性末端，由所述粘性末端将三角形张拉结构基元互相作用形成非常有序的3d晶体网络；具体地，所述工程化dna晶体由所述的制备方法得到的晶体。
18、进一步提供所述的晶体的功能化方法，其是将所述晶体浸泡在dmso中，先吸去dmso，然后使用1×tae/mg(mgac2)清洗晶体8-10次即可，向晶体液滴滴加带有荧光修饰的中心链，移液枪抽吸混合均匀，静置过夜即可。
19、优选地，所述带荧光修饰的中心链浓度为80-120μm，优选为100μm。
20、本专利技术也提供所述的功能化方法得到的功能化晶体在临床病理指标检测中的用途。
21、本专利技术获得晶体具有的应用潜力，例如现有技术中该类三角形triangle设计的晶体已经应用于生物领域作为生物催化剂(li z,liu l,zheng m,zhao j,seeman nc,maoc.making engineered 3d dna crystals robust.j am chem soc.2019；141(40):15850-15855.)。
22、本专利技术制备的dna晶体在溶剂二甲基亚砜(dmso)中会发生不可逆转的皱缩而非溶解、坍塌和碎裂，将带有荧光修饰的中心链加入晶体液滴中过夜发现晶体形状重新变为立体的三维结构且此时的晶体具有荧光，晶体中心链被替换。本申请可以使得中心链较复杂不易长成晶体的结构通过替换中心链由简本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种工程化DNA晶体的制备方法，其特征在于，具体步骤为：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，每条DNA单链的最终浓度为2～6μM，优选为4μM；所述DNA单链溶解时的溶剂优选为双蒸水；所述DNA单链经过hPAGE或HPLC纯化。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述退火步骤为95℃、5min，65℃、30min，50℃、30min，37℃、30min，22℃、30min，4℃、30min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，结晶是在30-35℃，结晶溶液盐浓度为0.4-0.6×TAE/Mg（MgAc2），结晶液池盐浓度为4-6×TAE/Mg（MgAc2）条件下进行；悬滴蒸气扩散法采用结晶板，例如购自Hampton公司的24孔结晶板。
5.根据权利要求1至4任一项所述的制备方法，其特征在于，还包括下述加固步骤：
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括下述步骤：
7.一种工程化DNA晶体，其特征在于，其由三角形张拉结构基元为基础形成非常有序的3D晶体网络，所述三角
8.根据权利要求7所述的工程化DNA晶体的功能化方法，其特征在于，将所述晶体浸泡在DMSO中，然后吸去DMSO，用1×TAE/Mg（MgAc2）清洗晶体8-10次，再向晶体液滴滴加功能性的中心链，例如带有荧光修饰的中心链（具体实例如L4链、L-CY5链），移液枪抽吸混合均匀，静置过夜即可。
9.根据权利要求8所述的晶体的功能化方法，其特征在于，所述功能性的中心链的浓度为80-120μM。
10.根据权利要求8或9所述的功能化方法得到的功能化晶体在临床病理指标检测中的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种工程化dna晶体的制备方法，其特征在于，具体步骤为：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，每条dna单链的最终浓度为2～6μm，优选为4μm；所述dna单链溶解时的溶剂优选为双蒸水；所述dna单链经过hpage或hplc纯化。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述退火步骤为95℃、5min，65℃、30min，50℃、30min，37℃、30min，22℃、30min，4℃、30min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，结晶是在30-35℃，结晶溶液盐浓度为0.4-0.6×tae/mg（mgac2），结晶液池盐浓度为4-6×tae/mg（mgac2）条件下进行；悬滴蒸气扩散法采用结晶板，例如购自hampton公司的24孔结晶板。
5.根据权利要求1至4任一项所述的制备方法，其特征在于，还包括下述加固步骤：
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括下述步骤：
7.一种工程化dna晶体，其特征在于，其由三角形张拉结...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵洁旻，冯昕瑜，张玲玲，韦书恒，徐莉，
申请(专利权)人：安徽医科大学，
类型：发明
国别省市：
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