【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及弱化磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因的地衣芽胞杆菌高产四氢嘧啶的方法及应用。
技术介绍
1、四氢嘧啶(ectoine)，又叫2-甲基-1,4,5,6-四氢甲基嘧啶-4-羧酸，是一种极性、易溶、生理ph范围内不带电荷的环状氨基酸衍生物。四氢嘧啶不仅是一种重要的渗透压调节剂，还是一种高效的生物保护剂。四氢嘧啶可以通过调节细胞内外的渗透压平衡，增强脂膜表面的水合作用，增强脂膜流态化，维持蛋白质和核酸的结构，来帮助细胞对抗高温、干燥、冷冻和辐射等多种逆境。因此，四氢嘧啶在酶工业、化妆品和生物医药等领域应用广泛。
2、目前在商业上，四氢嘧啶结构中存在手性碳原子结构，化学法合成难度大、高能耗、污染大，现阶段以微生物发酵法大规模生产四氢嘧啶为主，微生物发酵法工业生产主要通过嗜盐菌发酵合成四氢嘧啶。主要生产流程是先在高盐浓度的培养基中培养嗜盐菌，随后将细胞迅速转移到低盐浓度培养基中，将四氢嘧啶分泌到细胞外，随后再对产物进行收集提纯。目前微生物发酵法合成四氢嘧啶的生产方法存在一些缺陷：如高盐浓度的培养基对设备腐蚀性强，也提高了下游纯化过程的复杂程度，导致生产成本太高；高盐和低盐的反复冲击也会减慢细菌的生长速度，导致产量的下降。因此，可以利用基因工程改造非嗜盐工业微生物，使底盘细胞工厂可以在正常渗透压条件下高产四氢嘧啶，达到降低生产成本和提高生产效率的目的。
3、地衣芽胞杆菌中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(pcka)是糖酵解和三羧酸循环代谢途径中的一个分支点，在三羧酸循环中将草酰乙酸催化生成磷酸烯醇丙酮
4、本专利技术通过在地衣芽胞杆菌中弱化pcka，达到了四氢嘧啶产量提高的技术效果，说明弱化pcka是提高四氢嘧啶生产水平的有效策略。同时，本专利技术也明确了在地衣芽胞杆菌中缺失pcka基因不利于四氢嘧啶的合成。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供弱化磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因的地衣芽胞杆菌高产四氢嘧啶的方法，所述的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因编码的蛋白质为seq id no.2所示。
2、本专利技术的另一个目的在于提供弱化磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因的地衣芽胞杆菌高产四氢嘧啶的方法在制备四氢嘧啶中的应用。
3、为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：
4、弱化磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因的地衣芽胞杆菌高产四氢嘧啶的方法，包括将四氢嘧啶合成酶表达载体转入弱化磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因的地衣芽胞杆菌中进行表达。包含磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因的地衣芽孢杆菌均能实现本专利技术。
5、以上所述的方法中，优选的，所述的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因编码的蛋白质为seq id no.2所示。
6、以上所述的方法中，优选的，所述的四氢嘧啶合成酶为seq id no.3所示。
7、以上所述的应用中，优选的，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌dw2。
8、以上所述的应用中，优选的，所述的弱化磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因(pcka)的地衣芽胞杆菌的制备方法，是将pundh启动子替换pcka基因的启动子获得。
9、本专利技术的保护范围还包括：弱化磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因的地衣芽胞杆菌高产四氢嘧啶的方法在制备四氢嘧啶中的应用；
10、以上所述的应用中，优选的，其应用过程采用发酵方式，使用的发酵培养基为：5-10g/l蛋白胨，5-10g/l酵母粉，0.5-2g/l(nh4)2so4，0.2-0.8g/lmgso4，20-40g/l葡萄糖，ph7.0～7.2，其余为水。
11、与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
12、本专利技术人首次尝试构建弱化表达pcka基因的地衣芽胞杆菌，成功得到了弱化表达pcka基因的地衣芽胞杆菌异源四氢嘧啶表达宿主菌株，经过转入四氢嘧啶合成酶游离表达载体，发酵结果表明，弱化表达pcka显著提高了四氢嘧啶生产水平，与相应对照菌株相比，通过本专利技术构建得到的地衣芽胞杆菌的四氢密度产量提高了38％以上。本专利技术为地衣芽胞杆菌四氢嘧啶高效表达提供了一种新策略。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.弱化磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因的地衣芽胞杆菌高产四氢嘧啶的方法，包括将四氢嘧啶合成酶表达载体转入弱化磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因的地衣芽胞杆菌中进行表达。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的四氢嘧啶合成酶为SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌DW2。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的弱化磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因的地衣芽胞杆菌的制备方法，是将Pundh启动子替换磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因的启动子获得。
6.权利要求1所述的方法在制备四氢嘧啶中的应用。
7. 根据权利要求6所述的应用，其应用过程采用发酵方式，使用的发酵培养基为：5-10g/L蛋白胨，5-10 g/L酵母粉，0.5-2 g/L (NH4)2SO4，0.2-0.8 g/LMgSO4，20-40 g/L葡萄糖，pH 7.0~7.2，其余为水。
...【技术特征摘要】
1.弱化磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因的地衣芽胞杆菌高产四氢嘧啶的方法，包括将四氢嘧啶合成酶表达载体转入弱化磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因的地衣芽胞杆菌中进行表达。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因编码的蛋白质为seq id no.2所示。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的四氢嘧啶合成酶为seq id no.3所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌dw2。
【专利技术属性】
技术研发人员：陈守文，李绪杰，蔡冬波，董奥莹，杨钧茹，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：
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