【技术实现步骤摘要】
本公开总体上涉及分子生物学和医学领域，具体涉及一种利用rna剪接调节剂调控基因表达的核酸分子。
技术介绍
1、人类的多种疾病和基因缺陷相关。治疗这些疾病的一种有前景的方式是基因治疗。基因治疗中，人们将外源性遗传物质转移到靶细胞中，实现在核酸水平上对细胞生理机能进行干预，从而最终治疗疾病。例如，基因治疗可通过导入正常基因以替代缺失或异常突变的致病基因，或者通过基因沉默技术抑制有害的内源性基因的功能，达到治疗疾病的目的。基因治疗在过去20年的研究重点主要集中于开发和优化基因的递送系统。例如，工程化改造腺相关病毒(aav)衣壳可以提高其对特定器官的基因递送效率和靶向性。然而，基因治疗对被运载的治疗基因本身却研究较少。这些研究主要关注启动子技术、基因表达调控技术、以及限制特定细胞类型表达的3'调节元件等。
2、基因的表达水平是影响基因治疗效果的重要因素。如果治疗基因表达水平不足或不表达，则基因治疗无法获得预期的效果；另一方面，如果治疗基因的表达水平过高，即过表达，则基因治疗很可能对患者造成不期望的毒副作用。如何在基因被递送到体内后调节基因的表达水平是基因治疗研究中的难点和痛点问题。目前，相关的基因表达调控技术极为有限，其中一种思路是通过药物诱导rna剪接变化来调控基因表达。
3、目前已知可用于基因表达调控的rna剪接调节药物仅限于lmi070，种类单一。另一方面，目前已使用的rna剪接调节药物的调节能力也有限，有必要进一步提高。此外，可供选择的rna剪接变化的检测方法有限，需要开发更有效的检测技术。再者，现有技术
技术实现思路
1、为解决现有技术中存在的上述问题，提供了本公开的技术方案。
2、在本公开的第一方面，提供了一种可变剪接调节元件。所述可变剪接调节元件从5'端至3'端依次包含第一外显子、第一内含子、假外显子、第二内含子和第二外显子；所述假外显子含有与seq id no:1所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列；所述假外显子和所述第二内含子的交界处含有可变剪接调节小分子药物结合位点；所述可变剪接调节元件仅在假外显子中含有唯一起始密码子。所述起始密码子可以选自atg、gtg、acg、ctg、ata或ttg，优选为atg。
3、在一个实施例中，所述可变剪接调节小分子药物结合位点包含核苷酸序列atgagta，其中atga属于假外显子，gta属于第二内含子；或者，所述可变剪接调节小分子药物结合位点包含核苷酸序列agagta，其中aga属于假外显子，gta属于第二内含子。所述第一外显子的序列紧接所述第一内含子的序列为cag，所述第一内含子的序列紧接所述第一外显子的序列为gta；和/或，所述第一内含子的序列紧接所述假外显子的序列为tag，所述假外显子的序列紧接所述第一内含子的序列为gtt；和/或，所述第二内含子的序列紧接所述第二外显子的序列为cag，所述第二外显子的序列紧接所述第二内含子的序列为ttt。
4、在一个实施例中，所述第一内含子含有与seq id no:19和20所示序列具有至少95％(优选96％、97％、98％、99％或99.5％)同源性的核苷酸序列；所述第二内含子含有与seq id no:21所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。
5、在一个实施例中，所述第一内含子的核苷酸长度为41～500bp，优选为41～410bp，优选为41～140bp，优选为41～110bp；所述第二内含子的核苷酸长度为60～569bp，优选为60～479bp，优选为60～209bp，优选为60～129bp。
6、在一个实施例中，所述第一内含子含有与seq id no:3～5、22～25中任一项所示序列具有至少95％(优选96％、97％、98％、99％或99.5％)同源性的核苷酸序列；所述第二内含子含有与seq id no:6～8、26～32中任一项所示序列具有至少95％(优选96％、97％、98％、99％或99.5％)同源性的核苷酸序列。
7、优选的组合包括：
8、(a)第一内含子含有与seq id no:5所示序列具有至少95％(优选96％、97％、98％、99％或99.5％)同源性的核苷酸序列；所述第二内含子含有与seq id no:8所示序列具有至少95％(优选96％、97％、98％、99％或99.5％)同源性的核苷酸序列；或者，
9、(b)第一内含子含有与seq id no:4所示序列具有至少95％(优选96％、97％、98％、99％或99.5％)同源性的核苷酸序列；所述第二内含子含有与seq id no:7所示序列具有至少95％(优选96％、97％、98％、99％或99.5％)同源性的核苷酸序列；或者，
10、(c)第一内含子含有与seq id no:3所示序列具有至少95％(优选96％、97％、98％、99％或99.5％)同源性的核苷酸序列；所述第二内含子含有与seq id no:6所示序列具有至少95％(优选96％、97％、98％、99％或99.5％)同源性的核苷酸序列。
11、在一个实施例中，所述第一外显子含有与seq id no:2所示序列具有至少95％(优选96％、97％、98％、99％或99.5％)同源性的核苷酸序列；和/或，所述第二外显子含有与seq id no:9所示序列具有至少95％(优选96％、97％、98％、99％或99.5％)同源性的核苷酸序列。
12、在结合上述第一外显子和第二外显子核苷酸序列后，所述可变剪接调节元件进一步优选含有与seq id no:10～12任一项所示序列具有至少95％(优选96％、97％、98％、99％或99.5％)同源性的核苷酸序列。
13、在本公开的第二方面，本公开提供一种核酸分子，所述核酸分子包含本公开第一方面所述的可变剪接调节元件和位于本公开所述可变剪接调节元件3'端的目的基因；其中所述目的基因为一个或多个编码蛋白的基因和/或编码非编码rna的基因，并且所述编码蛋白的基因的第一个起始密码子atg被删除。
14、在一个实施例中，所述可变剪接调节元件的3'端与所述目的基因的5'端之间不存在任何核酸序列。
15、在一个实施例中，所述可变剪接调节元件的3'端与所述目的基因的5'端之间存在编码蛋白酶切割位点的序列，其中所述蛋白酶切割位点被哺乳动物蛋白酶切割或被自切割，例如2a肽，包括但不限于p2a(porcine teschovirus-1)、t2a(thosea asignavirus)、f2a(foot-and-mouth disease virus)、e2a(equine rhinitis avirus)，优选为p2a(seqid no:13)本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种可变剪接调节元件，所述可变剪接调节元件从5'端至3'端依次包含第一外显子、第一内含子、假外显子、第二内含子和第二外显子；所述假外显子含有与SEQ ID NO:1所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列；所述假外显子和所述第二内含子的交界处含有可变剪接调节小分子药物结合位点；所述可变剪接调节元件仅在假外显子中含有唯一起始密码子。
2.根据权利要求1所述的可变剪接调节元件，其中，所述可变剪接调节小分子药物结合位点包含核苷酸序列ATGAGTA，其中ATGA属于假外显子，GTA属于第二内含子；或者，
3.根据权利要求1或2所述的可变剪接调节元件，其中，所述第一外显子的序列紧接所述第一内含子的序列为CAG，所述第一内含子的序列紧接所述第一外显子的序列为GTA；和/或，
4.根据权利要求1～3任一项所述的可变剪接调节元件，其中，所述第一内含子含有与SEQ ID NO:19和20所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列；所述第二内含子含有与SEQ ID No:21所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。
5.根据权利要求1～4任一项所述
6.根据权利要求1～5任一项所述的可变剪接调节元件，其中，所述第一内含子含有与SEQ ID NO:3～5、22～25中任一项所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列；所述第二内含子含有与SEQ ID No:6～8、26～32中任一项所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。
7.根据权利要求1～6任一项所述的可变剪接调节元件，其中，
8.根据权利要求1～7任一项所述的可变剪接调节元件，其中，所述第一外显子含有与SEQ ID NO:2所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列；和/或，所述第二外显子含有与SEQ ID NO:9所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。
9.根据权利要求1～8任一项所述的可变剪接调节元件，其中，所述可变剪接调节元件含有与SEQ ID NO:10～12任一项所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。
10.一种核酸分子，包含权利要求1～9任一项所述可变剪接调节元件和位于所述可变剪接调节元件3'端的目的基因。
11.根据权利要求10所述的核酸分子，其中，所述可变剪接调节元件的3'端与所述目的基因的5'端之间不存在任何核酸序列。
12.根据权利要求10所述的核酸分子，其中，所述可变剪接调节元件的3'端与所述目的基因的5'端之间存在编码蛋白酶切割位点的序列，其中所述蛋白酶切割位点被哺乳动物蛋白酶切割或被自切割，并且所述编码蛋白酶切割位点的序列的碱基数是3的整数倍。
13.根据权利要求10～12中任一项所述的核酸分子，其中，所述可变剪接调节元件的5'端可操作地连接有启动子序列。
14.根据权利要求13所述的核酸分子，其中，所述启动子序列为哺乳动物细胞组成型启动子、哺乳动物细胞的特异性启动子、哺乳动物非编码RNA启动子或原核细胞启动子。
15.根据权利要求14所述的核酸分子，其中，所述哺乳动物细胞组成型启动子为CMV、CAG、CBG、EF1a、PGK1或Ubc；所述哺乳动物细胞的特异性启动子为Tnnt2、Nppa、Myl2、Mck、Nkx2.5、Syn、Mecp2、TBG、Pdx1、K14、Rpe65或SP-C；所述哺乳动物非编码RNA启动子为U6或H1；所述原核细胞启动子为T7、T3或SP6。
16.根据权利要求10～15中任一项所述的核酸分子，其中，所述核酸分子进一步包含转录后调节元件和/或微小RNA的靶序列。
17.根据权利要求16所述的核酸分子，其中，所述转录后调节元件(PRE)包含衍生自乙型肝炎(HPRE)、蝙蝠(BPRE)、地松鼠(GSPRE)、北极松鼠(ASPRE)、鸭(DPRE)、黑猩猩(CPRE)、长毛猴(WMPRE)或土拨鼠(WPRE)的转录后调节元件；
18.根据权利要求10～17中任一项所述的核酸分子，其中，所述核酸分子进一步包含多腺苷酸化信号(polyA)，任选地其中所述polyA设置在所述目的基因的3'端。
19.根据权利要求18所述的核酸分子，其中，所述polyA信号是SV40polyA、人生长激素(HGH)polyA、牛生长激素(BGH)polyA、β-珠蛋白polyA、α-...
【技术特征摘要】
1.一种可变剪接调节元件，所述可变剪接调节元件从5'端至3'端依次包含第一外显子、第一内含子、假外显子、第二内含子和第二外显子；所述假外显子含有与seq id no:1所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列；所述假外显子和所述第二内含子的交界处含有可变剪接调节小分子药物结合位点；所述可变剪接调节元件仅在假外显子中含有唯一起始密码子。
2.根据权利要求1所述的可变剪接调节元件，其中，所述可变剪接调节小分子药物结合位点包含核苷酸序列atgagta，其中atga属于假外显子，gta属于第二内含子；或者，
3.根据权利要求1或2所述的可变剪接调节元件，其中，所述第一外显子的序列紧接所述第一内含子的序列为cag，所述第一内含子的序列紧接所述第一外显子的序列为gta；和/或，
4.根据权利要求1～3任一项所述的可变剪接调节元件，其中，所述第一内含子含有与seq id no:19和20所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列；所述第二内含子含有与seq id no:21所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。
5.根据权利要求1～4任一项所述的可变剪接调节元件，其中，所述第一内含子的核苷酸长度为41～500bp，优选为41～410bp，优选为41～140bp，优选为41～110bp；所述第二内含子的核苷酸长度为60～569bp，优选为60～479bp，优选为60～209bp，优选为60～129bp。
6.根据权利要求1～5任一项所述的可变剪接调节元件，其中，所述第一内含子含有与seq id no:3～5、22～25中任一项所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列；所述第二内含子含有与seq id no:6～8、26～32中任一项所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。
7.根据权利要求1～6任一项所述的可变剪接调节元件，其中，
8.根据权利要求1～7任一项所述的可变剪接调节元件，其中，所述第一外显子含有与seq id no:2所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列；和/或，所述第二外显子含有与seq id no:9所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。
9.根据权利要求1～8任一项所述的可变剪接调节元件，其中，所述可变剪接调节元件含有与seq id no:10～12任一项所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。
10.一种核酸分子，包含权利要求1～9任一项所述可变剪接调节元件和位于所述可变剪接调节元件3'端的目的基因。
11.根据权利要求10所述的核酸分子，其中，所述可变剪接调节元件的3'端与所述目的基因的5'端之间不存在任何核酸序列。
12.根据权利要求10所述的核酸分子，其中，所述可变剪接调节元件的3'端与所述目的基因的5'端之间存在编码蛋白酶切割位点的序列，其中所述蛋白酶切割位点被哺乳动物蛋白酶切割或被自切割，并且所述编码蛋白酶切割位点的序列的碱基数是3的整数倍。
13.根据权利要求10～12中任一项所述的核酸分子，其中，所述可变剪接调节元件的5'端可操作地连接有启动子序列。
14.根据权利要求13所述的核酸分子，其中，所述启动子序列为哺乳动物细胞组成型启动子、哺乳动物细胞的特异性启动子、哺乳动物非编码rna启动子或原核细胞启动子。
15.根据权利要求14所述的核酸分子，其中，所述哺乳动物细胞组成型启动子为cmv、cag、cbg、ef1a、pgk1或ubc；所述哺乳动物细胞的特异性启动子为tnnt2、nppa、myl2、mck、nkx2.5、syn、mecp2、tbg、pdx1、k14、rpe65或sp-c；所述哺乳动物非编码rna启动子为u6或h1；所述原核细胞启动子为t7、t3或sp6。
16.根据权利要求10～15中任一项所述的核酸分子，其中，所述核酸分子进一步包含转录后调节元件和/或微小rna的靶序列。
17.根据权利要求16所述的核酸分子，其中，所述转录后调节元件(pre)包含衍生自乙型肝炎(hpre)、蝙蝠(bpre)、地松鼠(gspre)、北极松鼠(aspre)、鸭(dpre)、黑猩猩(cpre)、长毛猴(wmpre)或土拨鼠(wpre)的转录后调节元件；
18.根据权利要求10～17中任一项所述的核酸分子，其中，所述核酸分子进一步包含多腺苷酸化信号(polya)，任选地其中所述polya设置在所述目的基因的3'端。
19.根据权利要求18所述的核酸分子，其中，所述polya信号是sv40polya、人生长激素(hgh)polya、牛生长激素(bgh)polya、β-珠蛋白polya、α-珠蛋白polya、卵清蛋白polya、κ-轻链polya或合成polya。
20.根据权利要求10～19中任一项所述的核酸分子，其中，所述可变剪接调节元件能够与可变剪接调节小分子药物结合，所述可变剪接调节小分子药物为lmi070、与lmi070在所述可变剪接调节元件上具有相同结合位点的衍生物或lmi070药学上可接受的盐；或者，所述可变剪接调节小分子药物为risdiplam、与risdiplam在所述可变剪接调节元件上具有相同结合位点的衍生物或risdiplam药学上可接受的盐。
21.根据权利要求10～20中任一项所述的核酸分子，其中，所述编码蛋白的基因为编码核酸酶的基因，和/或编码治疗蛋白的基因，和/或编码报告或标记蛋白的基因，和/...
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