【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于北柴胡种子组织培养，特别涉及一种北柴胡种子培养无菌苗的方法。
技术介绍
1、北柴胡为伞形科柴胡属多年生草本植物，其有效成分为柴胡皂苷、黄酮、挥发油和柴胡多糖等，以根入药，具有疏散退热、疏肝解郁、升举阳气的功效，用于感冒发热，寒热往来，胸胁胀痛，月经不调，子宫脱垂，脱肛等症。
2、北柴胡是大宗常用药材，需求量大，然而由于多年的滥采滥挖和无序利用，北柴胡野生资源遭到严重破坏，药材供应主要以人工种植品为主。人工种植存在着种源混杂、种子发芽率低、出苗不整齐等突出问题，从而导致北柴胡产量下降和品质的不稳定。利用组织培养和细胞培养技术生产次生代谢产物用于满足日益增长的医药等行业的需求，是植物组织培养中的新兴领域，而无菌苗的获得是植物组织培养中一个起始性和关键性的环节，因此，开展北柴胡种子的组织培养技术研究，高效获取大量优质无菌苗，不仅可为北柴胡的育种研究、基因工程等提供材料，也可为工业化次生代谢产物生产提供材料基础。
3、目前，北柴胡多以幼嫩叶片、茎段、根段等为外植体进行组织培养，其种子不易作为外植体进行组织培养，主要是与其种子细小、侧面具有果棱的特性有关，北柴胡种子表面具有5条明显的棱，这为杂菌附着提供了条件，消毒较为困难。《安徽农业科学》期刊2015年刊登的第一作者为刘茹的论文“柴胡组织培养外植体消毒条件的研究”提出了“柴胡种子作为外植体组织培养最佳消毒条件是100g/l naclo处理30min，污染率仅为6.7％，存活率为86.7％”，采用该消毒条件对(北)柴胡种子进行消毒处理存在消毒处理时间长
技术实现思路
1、为解决以上现有技术的不足，本专利技术提出了一种北柴胡种子培养无菌苗的方法。
2、本专利技术的技术方案是这样实现的：
3、一种北柴胡种子培养无菌苗的方法，包括如下操作步骤：
4、(1)选取干净、饱满的北柴胡种子并装在细纱网袋中，于纯净水中浸泡10-15h；
5、(2)将装有北柴胡种子的细纱网袋从步骤(1)的水中取出并放入添加有洗洁精的水中，先用手揉搓2-5min，再用自来水冲洗20-40min；
6、(3)将北柴胡种子从细纱网袋中取出，吸干水分；
7、(4)将上一步得到的北柴胡种子在体积分数为75％酒精中浸泡15-60s；
8、(5)倒掉酒精，将所得的北柴胡种子先用无菌水冲洗2-5次，再以吐温-80和10wt％次氯酸钠溶液消毒3-15min，之后用无菌水冲洗4-5次，最后吸干水分；
9、(6)采用滤纸桥法进行培养：将滤纸折叠成杯状并倒扣于添加有培养基的试管中，杯状滤纸的杯底部分位于培养基之上，其余部分浸入培养基之内，接着对该试管进行高温高压灭菌处理，然后放凉待用，最后将上一步得到的北柴胡种子接入放凉待用的试管中的杯状滤纸的杯底部分上，一个试管中接入1-3粒；为了进一步避免交叉污染，优选一个试管中接入1粒种子。
10、优选的，步骤(1)中，浸泡时间为12h；步骤(2)中，揉搓时间为3min，冲洗时间为30min；步骤(3)中采用滤纸吸干水分；步骤(4)中，浸泡时间为30s；步骤(5)中采用无菌滤纸吸干水分，所述无菌水为无菌蒸馏水。
11、更为优选的，步骤(5)中，消毒的具体操作为：向装有所述北柴胡种子的无菌试管或无菌三角瓶中加入1滴吐温-80和10wt％的次氯酸钠溶液，次氯酸钠溶液没过所述北柴胡种子，消毒时间6min。
12、最为优选的，步骤(6)中，所述滤纸为直径75～85mm的圆片状，所述试管的规格为30mm×100mm，所述培养基具体为20ml、1/2ms培养基(固体或者液体均可以，优选为1/2ms液体培养基)；折叠时，将所述圆片状滤纸盖在所述试管口上并按压，使其表面形成一圆形压痕，该压痕与所述圆片状滤纸为同心圆，以该压痕为界，将滤纸折叠为杯状结构，压痕内部区域为杯底、压痕外部区域为杯壁；为了方便地放入试管，折叠时适当缩小压痕内部面积，使杯底面积略小于试管口的内表面积。
13、本专利技术以吐温-80和10wt％次氯酸钠溶液对北柴胡种子进行消毒，并采用滤纸桥法在试管中进行培养，与现有技术相比，本专利技术提出的北柴胡种子培养无菌苗的方法大幅缩短了北柴胡种子的消毒处理时间，且可将北柴胡种子作为外植体进行组织培养的污染率控制在较低的水平，并可显著提高北柴胡种子的发芽率，有助于快速获得北柴胡无菌苗，为北柴胡的育种研究、基因工程等提供材料。
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1.一种北柴胡种子培养无菌苗的方法，其特征在于：包括如下操作步骤：
2.根据权利要求1所述的北柴胡种子培养无菌苗的方法，其特征在于：步骤(1)中，浸泡时间为12h；步骤(2)中，揉搓时间为3min，冲洗时间为30min；步骤(3)中采用滤纸吸干水分；步骤(4)中，浸泡时间为30s；步骤(5)中采用无菌滤纸吸干水分，所述无菌水为无菌蒸馏水。
3.根据权利要求1所述的北柴胡种子培养无菌苗的方法，其特征在于：步骤(5)中，消毒的具体操作为：向装有所述北柴胡种子的无菌试管或无菌三角瓶中加入1滴吐温-80和10wt％的次氯酸钠溶液，次氯酸钠溶液没过所述北柴胡种子，消毒时间6min。
4.根据权利要求1所述的北柴胡种子培养无菌苗的方法，其特征在于：步骤(6)中，所述滤纸为直径75～85mm的圆片状，所述试管的规格为30mm×100mm，所述培养基具体为20ml、1/2MS培养基。
【技术特征摘要】
1.一种北柴胡种子培养无菌苗的方法，其特征在于：包括如下操作步骤：
2.根据权利要求1所述的北柴胡种子培养无菌苗的方法，其特征在于：步骤(1)中，浸泡时间为12h；步骤(2)中，揉搓时间为3min，冲洗时间为30min；步骤(3)中采用滤纸吸干水分；步骤(4)中，浸泡时间为30s；步骤(5)中采用无菌滤纸吸干水分，所述无菌水为无菌蒸馏水。
3.根据权利要求1所述的北柴胡种子培养无菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：王晓民，韩丽丽，胡晓丽，许爱玲，关望辉，张鹏飞，王耀琴，吕建平，张相斌，
申请(专利权)人：山西农业大学棉花研究所，
类型：发明
国别省市：
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