【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种经修饰的cas3移位酶，特别是涉及一种能够控制目标多核苷酸穿过生物纳米孔移动的dna移位酶，并且特别有助于对多核苷酸进行测序，属于基因工程和遗传工程领域。
技术介绍
1、近些年发展起来的纳米孔测序技术是一种新型的单分子测序技术，其利用电场力驱动单链多核苷酸穿过嵌在绝缘磷脂膜上的纳米级生物孔道蛋白，由于不同的碱基大小，每个核苷酸分子在通过生物纳米孔时会产生特征性的阻碍电流，记录下的这些特征电流信号对应于目标核酸的序列。
2、在“链测序”方法中，单个多核苷酸链通过所述生物纳米孔从而实现核苷酸序列的鉴定。相比于其他测序技术，这种测序技术的优势在于成本低，无需pcr扩增，快速实时便捷，测序读长长(超过150kb)，以及rna及表观遗传修饰直接测序的能力。其被认为是测序领域的革命性技术，具有不可估量的应用价值。
3、但是，纳米孔测序技术也存在严重的限制。在电场作用下，单链多核苷酸穿过纳米孔的速度非常快以至于难以从系统噪音中分辨出单个核苷酸的电流阻碍信号。因此，为了实现对核苷酸的鉴定，链测序使用多核苷酸结合的分子马达来控制多核苷酸穿过所述生物纳米孔的移动。然而，分子马达和多核苷酸的结合并非一成不变，在其控制多核苷酸移动时，尤其是面对很长的核苷酸序列时，分子马达会出现从多核苷酸上发生脱落的问题。此外，在链测序这种单分子水平的测序技术中，分子马达存在许多出乎意料的单分子动态行为，比如某些马达蛋白由于活性差，会出现停滞的现象，从而引起孔道的阻塞，降低了测序的通量。其次，马达蛋白在多核苷酸上的移位会出现向前
技术实现思路
1、针对上述技术问题，本专利技术克服了现有技术中多核苷酸穿孔速度过快的问题，提供了一种修饰的tfu cas3移位酶，其在链测序过程中对于控制多核苷酸穿孔运动是非常有用的。
2、cas3是细菌用于抵抗外来入侵遗传因子的crispr-cas获得性免疫系统的一个关键组分，它是一种嵌合酶，其n端为hd-核酸酶结构域，c端是atp依赖的单链dna移位酶结构域，移位酶结构域又分为四个亚结构域，分别是reca1域(reca式结构域)、reca2域(reca式结构域)、连接域、ctd域，相应的tfu cas3蛋白的结构信息可以从蛋白质数据库(pdb)中获得。
3、为了用于多核苷酸测序，本专利技术提供了一种修饰的tfu cas3移位酶，通过对其hd-核酸酶活性域中关键位点的氨基酸进行突变，使其丧失核酸酶活性，成为一种单纯的单链dna移位酶。
4、在本专利技术优选的实施方案中，所述hd-核酸酶活性域中关键位点的氨基酸突变是d84a突变。
5、在本专利技术进一步优选的实施方案中，所述的移位酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
6、为了用于多核苷酸测序，本专利技术提供了一种修饰的tfu cas3移位酶，其是将tfucas3移位酶中至少一个天然半胱氨酸残基突变为丙氨酸或者丝氨酸，所述tfu cas3移位酶保留其控制多核苷酸移动的能力。
7、tfu cas3移位酶本身存在的天然半胱氨酸残基位点为：36、75、208、293、295、584、89、690、838、853、873和939。
8、在本专利技术优选的实施方案中，优选的突变组合包括c293s、c295s、c838s、c853s、c873s、c939s和d84a。
9、在本专利技术进一步优选的实施方案中，所述的移位酶的氨基酸序列如seq id no.3所示。
10、为了用于多核苷酸测序，本专利技术提供了一种修饰的tfu cas3移位酶，至少两个半胱氨酸残基或者非天然氨基酸被引入tfu cas3移位酶的ctd域、reca1域或reca2域中，所述tfu cas3移位酶保留其控制多核苷酸移动的能力。
11、上述修饰不妨碍移位酶与多核苷酸的结合。这些修饰的半胱氨酸或者非天然氨基酸彼此连接通常可以降低多核苷酸从移位酶脱离的能力。通过引入这些修饰增加了移位酶控制多核苷酸穿孔运动的能力，尤其当多核苷酸链长度增加时，依然可以稳定控制多核苷酸移动而不会从多核苷酸上发生脱落。其中：
12、ctd域中的修饰位点有：e921-t926，p938-f944，m870-i881，l849-f856；
13、reca1域中的修饰位点有：v592-q604，r622-r628；
14、reca2域中的修饰位点有：m373-l383，r331-a339。
15、因此，在本专利技术优选的实施方案中，突变位点包括e921-t926、p938-f944、m870-i881、l849-f856、v592-q604、r622-r628、m373-l383和r331-a339。
16、在本专利技术进一步优选的实施方案中，优选的突变组合包括l376c、v877c、c293s、c295s、c838s、c853s、c873s、c939s和d84a。
17、在本专利技术更加优选的实施方案中，所述的移位酶的氨基酸序列如seq id no.5所示。
18、为了用于多核苷酸测序，本专利技术提供了一种修饰的tfu cas3移位酶，其是用多核苷酸结合部分替换tfu cas3移位酶的hd-核酸酶活性域，所述tfu cas3移位酶保留其控制多核苷酸移动的能力。
19、本专利技术采用基因融合的方法来制备所述的tfu cas3移位酶，具体的可以是，将tfucas3的n端hd-核酸酶域的氨基酸序列删除，然后将多核苷酸结合部分的氨基酸序列插入到tfu cas3移位酶域的氨基酸序列中，构建成融合基因。
20、在本专利技术优选的实施方案中，所述的多核苷酸结合部分包括一个或多个结构域。
21、在本专利技术进一步优选的实施方案中，所述的结构域是从螺旋-发卡-螺旋(hhh)结构中选取的相应的结构域。
22、在本专利技术更加优选的实施方案中，所述的移位酶的氨基酸序列如seq id no.7所示。
23、在本专利技术优选的实施方案中，所述的移位酶结合到单链多核苷酸或双链多核苷酸的内部核苷酸。
24、本专利技术另一方面提供了一种编码本专利技术的移位酶的核苷酸序列。
25、在本专利技术优选的实施方案中，所述核苷酸序列如seq id no.2、seq id no.4、seqid no.6和seq id no.8所示。
26、本专利技术另一方面提供了一种构建体，所述构建体包含本专利技术的移位酶，和用于结合多核苷酸的结合部分。
27、在本专利技术优选的实施方案中，所述结合部分选自真核单链结合蛋白、细菌单链结合蛋白、古生单链结合蛋白、病毒单链结合蛋白会或双链结合蛋白。
28、本专利技术另一方面提供了本专利技术的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种修饰的Tfu Cas3移位酶，其特征在于，通过对其HD-核酸酶活性域中关键位点的氨基酸进行突变，使其丧失核酸酶活性，成为一种单纯的单链DNA移位酶。
2.根据权利要求1所述的移位酶，其中HD-核酸酶活性域中关键位点的氨基酸突变是D84A突变。
3.根据权利要求2所述的移位酶，所述的移位酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.一种修饰的Tfu Cas3移位酶，其特征在于，将Tfu Cas3移位酶中至少一个天然半胱氨酸残基突变为丙氨酸或者丝氨酸，所述Tfu Cas3移位酶保留其控制多核苷酸移动的能力。
5.根据权利要求4所述的移位酶，其中突变组合包括C293S、C295S、C838S、C853S、C873S、C939S和D84A。
6.根据权利要求5所述的移位酶，所述的移位酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
7.一种修饰的Tfu Cas3移位酶，其特征在于，至少两个半胱氨酸残基或者非天然氨基酸被引入Tfu Cas3移位酶的CTD域、RecA1域或RecA2域中，所述Tfu Cas3移位
8.根据权利要求7所述的移位酶，其中突变位点包括E921-T926、P938-F944、M870-I881、L849-F856、V592-Q604、R622-R628、M373-L383和R331-A339。
9.根据权利要求8所述的移位酶，其中突变组合包括L376C、V877C、C293S、C295S、C838S、C853S、C873S、C939S和D84A。
10.根据权利要求9所述的移位酶，所述的移位酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
11.一种修饰的Tfu Cas3移位酶，其特征在于，用多核苷酸结合部分替换Tfu Cas3移位酶的HD-核酸酶活性域，所述Tfu Cas3移位酶保留其控制多核苷酸移动的能力。
12.根据权利要求11所述的移位酶，所述的多核苷酸结合部分包括一个或多个结构域。
13.根据权利要求12所述的移位酶，所述的结构域是从螺旋-发卡-螺旋(HhH)结构中选取的相应的结构域。
14.根据权利要求13所述的移位酶，所述的移位酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的移位酶，其特征在于，所述的移位酶结合到单链多核苷酸或双链多核苷酸的内部核苷酸。
16.编码权利要求1-15中任一项所述的移位酶的核苷酸序列。
17.根据权利要求16所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示。
18.一种构建体，其特征在于，所述构建体包含权利要求1-15中任一项所述的移位酶和用于结合多核苷酸的结合部分。
19.根据18所述的构建体，其特征在于，所述结合部分选自真核单链结合蛋白、细菌单链结合蛋白、古生单链结合蛋白、病毒单链结合蛋白会或双链结合蛋白。
20.权利要求1-15中任一项所述的移位酶或权利要求16或17所述的核苷酸序列或权利要求18或19所述的构建体在表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过纳米孔中的应用。
21.一种表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过纳米孔的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-15中任一项所述的移位酶或权利要求16或17所述的核苷酸序列或权利要求18或19所述的构建体。
22.一种表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过纳米孔的装置，其特征在于，所述装置包含权利要求1-15中任一项所述的移位酶或权利要求16或17所述的核苷酸序列或权利要求18或19所述的构建体。
23.一种表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过纳米孔的方法，其特征在于，包括以下步骤：
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述一个或多个特征选自目标多核苷酸的来源、长度、同一性、序列、二级结构或目标多核苷酸是否被修饰。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其特征在于，所述的一个或多个特征通过电测量和/或光测量进行。
26.根据权利要求23-25中任一项所述的方法，其特征在于，所述的目标多核苷酸为单链、双链、或至少一部分是双链的。
27.根据权利要求23-26中任一项所述的方法，其特征在于，所述的纳米孔为跨膜孔，所述的跨膜孔为生物孔、固态孔或生物与固态交杂的孔。
28.一种包含权利要求16或17所述的核苷酸序...
【技术特征摘要】
1.一种修饰的tfu cas3移位酶，其特征在于，通过对其hd-核酸酶活性域中关键位点的氨基酸进行突变，使其丧失核酸酶活性，成为一种单纯的单链dna移位酶。
2.根据权利要求1所述的移位酶，其中hd-核酸酶活性域中关键位点的氨基酸突变是d84a突变。
3.根据权利要求2所述的移位酶，所述的移位酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
4.一种修饰的tfu cas3移位酶，其特征在于，将tfu cas3移位酶中至少一个天然半胱氨酸残基突变为丙氨酸或者丝氨酸，所述tfu cas3移位酶保留其控制多核苷酸移动的能力。
5.根据权利要求4所述的移位酶，其中突变组合包括c293s、c295s、c838s、c853s、c873s、c939s和d84a。
6.根据权利要求5所述的移位酶，所述的移位酶的氨基酸序列如seq id no.3所示。
7.一种修饰的tfu cas3移位酶，其特征在于，至少两个半胱氨酸残基或者非天然氨基酸被引入tfu cas3移位酶的ctd域、reca1域或reca2域中，所述tfu cas3移位酶保留其控制多核苷酸移动的能力。
8.根据权利要求7所述的移位酶，其中突变位点包括e921-t926、p938-f944、m870-i881、l849-f856、v592-q604、r622-r628、m373-l383和r331-a339。
9.根据权利要求8所述的移位酶，其中突变组合包括l376c、v877c、c293s、c295s、c838s、c853s、c873s、c939s和d84a。
10.根据权利要求9所述的移位酶，所述的移位酶的氨基酸序列如seq id no.5所示。
11.一种修饰的tfu cas3移位酶，其特征在于，用多核苷酸结合部分替换tfu cas3移位酶的hd-核酸酶活性域，所述tfu cas3移位酶保留其控制多核苷酸移动的能力。
12.根据权利要求11所述的移位酶，所述的多核苷酸结合部分包括一个或多个结构域。
13.根据权利要求12所述的移位酶，所述的结构域是从螺旋-发卡-螺旋(hhh)结构中选取的相应的结构域。
14.根据权利要求13所述的移位酶，所述的移位酶的氨基酸序列如seq id no.7所示。
15.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：陆志方，
申请(专利权)人：北京普译生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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