【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞培养领域，特别是涉及一种鸡x期胎盘原始生殖细胞分离与建系的方法。
技术介绍
1、原始生殖细胞(primordial germ cells,pgcs)是动物体内所有生殖细胞的祖细胞，具有自我更新能力，并能够分化为精子和卵母细胞，主要功能是将遗传信息传递到下一代，对于物种的延续至关重要。鸟类pgcs最先起源于eg&k x期胚胎的中央盘状明区(xpgcs)，随后pgcs跟随胚胎外胚层迁移到生殖新月，进一步发育侵入血管进入血液循环系统，最终迁移并定植在性腺。鸟类pgcs这种特殊的迁移途径，结合特定的分离培养方法，使得pgcs可以进行体外分离培养。根据胚胎发育过程中pgcs特定的迁移路线，可以从hh 5～8期胚胎的生殖新月、hh 14～17期的胚胎血液和hh 27～31期的胚胎性腺中分离出pgcs。x期胚胎内约有30个pgcs，生发新月形成时约有200～250个，hh 14～17期胚胎血液内约有380个，孵化7天后发育中的胚胎性腺中有1000多个。体外培养的pgcs成为了一种体外高效生产基因编辑动物的工具。在动物育种过程，pgcs可以用于特定生产抗病、生长速度快等性状优良的基因编辑品种，并且对珍惜鸟类种质资源保护具有重要的价值，且研究原始生殖干细胞对生殖疾病或生物发育机理研究等方面均有极其深远的意义。
2、目前hh 5～8期胚胎生殖新月期、hh 14～17期胚胎血液和hh 27～31期性腺中的pgcs已具有成熟的分离培养方法。然而，在x期胚胎中，已经拥有6万个细胞，其中仅包含30多个pgcs，不到细胞
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种鸡x期胎盘原始生殖细胞分离与建系的方法，以解决上述存在的技术难题，该方法具有操作简便、实验材料易获得、建系成功率高、建系时间短、高效稳定的特征，为后续制备基因编辑鸡和保护家禽种质资源提供新策略。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供一种鸡x期胎盘原始生殖细胞分离与建系的方法，包括使用带孔滤纸膜从x期鸡胚中分离胚盘、利用差异贴壁从胚盘中分离、纯化原始生殖细胞；将所述原始生殖细胞置于体外长期培养液中，利用小鼠胎儿成纤维细胞作为饲养层共培养的方法进行培养，实现扩增建系。
4、所述x期鸡胚来源于所收集的当天新鲜产下的受精种蛋，对应孵化时间为0小时。
5、优选的是，所述带孔滤纸膜为内含小孔的正方形滤纸，边长为15mm，孔径为7mm。
6、优选的是，分离所述原始生殖细胞的步骤包括：用带孔滤纸膜贴于x期鸡胚的胚盘顶部的卵黄膜，分离出所述胚盘，并将所述胚盘转移至预热至37℃的pbs溶液中洗涤，重复洗涤2-3次，加入所述体外长期培养液吹打，直至所述胚盘的组织成为细胞悬液，即获得所述原始生殖细胞。
7、纯化所述原始生殖细胞的步骤包括：将所述原始生殖细胞转移到饲养层，在37℃、5％co2培养48h，收集未贴壁的悬浮细胞经离心后，用所述体外长期培养液重悬，之后转至新的饲养层继续培养。
8、优选的是，经分离、纯化后的所述原始生殖细胞使用所述体外长期培养液进行原代培养，每1.5天进行1/3换液，每3天更新一次新的培养层。
9、优选的是，将所述原始生殖细胞培养至第15天时，按所述原始生殖细胞∶所述体外长期培养液体积为(1∶2)-(1∶3)的比例传代至新的饲养层培养；第27天时，再次以所述原始生殖细胞∶所述体外长期培养液体积为(1∶2)-(1∶3)的比例传代至新的饲养层培养；其余传代时间，每3天按照所述原始生殖细胞∶所述体外长期培养液体积为1:1传代到新的饲养层进行培养，每1.5天进行1/3换液。
10、优选的是，所述原始生殖细胞培养至第36天时，总细胞数量达到100万个。
11、优选的是，所述饲养层在使用前需要提前三天使用1mg/ml的丝裂霉素c处理2h，之后铺至相应细胞培养板，1.5天使用含有10％fbs的dmem f12(bi)完全培养液更换培养液，第3天可以接种原始生殖细胞使用。
12、本专利技术公开了以下技术效果：
13、本专利技术公开了一种鸡x期胎盘原始生殖细胞分离与建系的方法，通过贴附特制滤纸法从x期dazl-mcherry基因编辑鸡胚中分离胚盘，并从胚盘中分离、纯化x期原始生殖细胞，将分离得到的xpgcs接种至饲养层配和优化的pgcs体外长期培养系统进行培养，在36天内从30多个xpgcs扩增至1×106个，实现首例x期鸡胚盘原始生殖细胞快速分离培养与建系。另外，检测了xpgcs的体外增殖和免疫细胞学特征，发现xpgcs可以显著迁移到胚胎性腺，并呈现原始生殖细胞标记蛋白阳性，验证了本专利技术中所述xpgcs细胞系的原始生殖细胞特征。
14、本专利技术公开的方法具有操作简便、实验材料易获得、建系成功率高、建系时间短、高效稳定的特征，为研究家禽早期原始生殖细胞发育生物学提供参考意义，为后续制备基因编辑鸡和保护家禽种质资源提供新策略。
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1.一种鸡X期胎盘原始生殖细胞分离与建系的方法，其特征在于，包括使用带孔滤纸膜从X期鸡胚的胚盘中分离、纯化获取原始生殖细胞；将所述原始生殖细胞置于体外长期培养液中，利用小鼠胎儿成纤维细胞作为饲养层共培养的方法进行培养，实现扩增建系。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述X期鸡胚来源于所收集的当天新鲜产下的受精种蛋。
3.如权利要求1所述的方法，所述带孔滤纸膜为内含小孔的正方形滤纸，边长为15mm，孔径为7mm。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，分离所述X期原始生殖细胞的步骤包括：用带孔滤纸膜贴于X期鸡胚的胚盘顶部的卵黄膜，分离出所述胚盘，并将所述胚盘转移至预热至37℃的PBS溶液中洗涤，重复洗涤2-3次，之后用所述体外长期培养液吹打，直至所述胚盘的组织成为细胞悬液，即得所述原始生殖细胞混合液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，纯化所述原始生殖细胞的步骤包括：将所述原始生殖细胞混合液转移到饲养层，在37℃、5％CO2培养48h，收集未贴壁的悬浮细胞经离心后，用所述体外长期培养液重悬，之后转至新的饲养层继续培养。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，经分离、纯化后的所述原始生殖细胞使用所述体外长期培养液进行原代培养，每1.5天进行1/3换液，每3天更新一次新的培养层。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述原始生殖细胞培养至第15天时，按所述原始生殖细胞∶所述体外长期培养液体积为(1∶2)-(1∶3)的比例传代至新的饲养层培养；第27天时，再次按所述原始生殖细胞∶所述体外长期培养液体积为(1∶2)-(1∶3)的比例传代至新的饲养层培养；其余传代时间，每3天按照所述原始生殖细胞∶所述体外长期培养液体积为1:1的比例传代到新的饲养层进行培养，每1.5天进行1/3量换液。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述原始生殖细胞培养至第36天时，总细胞数量达到100万个。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MEF饲养层在使用前需要提前三天使用1mg/mL的丝裂霉素C处理2h，之后铺至相应细胞培养板，1.5d使用含有10％FBS的DMEM F12(BI)完全培养液更换培养液，第3d可以接种原始生殖细胞。
...【技术特征摘要】
1.一种鸡x期胎盘原始生殖细胞分离与建系的方法，其特征在于，包括使用带孔滤纸膜从x期鸡胚的胚盘中分离、纯化获取原始生殖细胞；将所述原始生殖细胞置于体外长期培养液中，利用小鼠胎儿成纤维细胞作为饲养层共培养的方法进行培养，实现扩增建系。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述x期鸡胚来源于所收集的当天新鲜产下的受精种蛋。
3.如权利要求1所述的方法，所述带孔滤纸膜为内含小孔的正方形滤纸，边长为15mm，孔径为7mm。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，分离所述x期原始生殖细胞的步骤包括：用带孔滤纸膜贴于x期鸡胚的胚盘顶部的卵黄膜，分离出所述胚盘，并将所述胚盘转移至预热至37℃的pbs溶液中洗涤，重复洗涤2-3次，之后用所述体外长期培养液吹打，直至所述胚盘的组织成为细胞悬液，即得所述原始生殖细胞混合液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，纯化所述原始生殖细胞的步骤包括：将所述原始生殖细胞混合液转移到饲养层，在37℃、5％co2培养48h，收集未贴壁的悬浮细胞经离心后，用所述体外长期培养液重悬，之后转至新的饲养...
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