【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学，涉及抗狂犬病病毒的抗体，特别涉及一种狂犬病毒抗体中和抗体检测试剂盒制备方法及初步应用。
技术介绍
1、狂犬病病毒rabv为单股负链rna病毒，属于弹状病毒科(rhabdoviridae)狂犬病毒属(lyssavirus)。外形呈弹状，核衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜，内含有单链rna，是引起狂犬病的病原体。rabv容易为日光、紫外线、甲醛、升汞季胺类化合物(如新洁尔灭)、脂溶剂、75％酒精等灭活，其悬液经56℃灭活30-60分钟或100℃灭活2分钟，病毒即可灭活。病毒于-80℃或冻干后置0-4℃中可保持活力数年。rabv包含5种蛋白，即糖蛋白(g)、核蛋白(n)、双聚酶(l)、磷蛋白(ns)及基质(m)。糖蛋白g为主要的保护性抗原，可诱导机体产生中和抗体，对抗病毒攻击。
2、预防狂犬病可以通过规范的暴露前和暴露后处置来实现，接种狂犬病疫苗是重要的处置手段，疫苗免疫后测定血清内的狂犬病病毒中和抗体滴度水平可以评价疫苗接种是否达到保护性水平。who认为，血清中的有效结合狂犬病毒的中和抗体效价≥0.5国际单位(iu/ml)才具有足够的保护性，如果中和抗体效价<0.5iu/ml，必须给予多个剂量的加强免疫，直到抗体达到要求为止。rabv-g蛋白是唯一诱导机体产生病毒中和抗体的蛋白，因此，利用rabv-g蛋白来检测血清中的中和抗体效价是最科学和直接的方法。
3、目前检测狂犬病病毒中和抗体的方法有快速荧光灶抑制试验(rapidfluorescent focus inhibition tes
4、rffit法和favn法都需要使用狂犬病固定毒株cvs-11，涉及活毒操作等原因，无法进行大批量的高通量检测，使这些方法的普及使用受到了限制。而酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,elisa)是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术，特别适用于大批量的高通量检测。但现有elisa试剂盒技术中包被抗原大多是狂犬全病毒或由病毒纯化的糖蛋白，同时酶标二抗采用的大多是针对多克隆抗体的，大大降低了中和抗体检测的灵敏度和特异性，往往容易出现假阳性和假阴性问题，其检测质量得不到认可。
5、例如中国专利申请文献cn 102175867a公开了一种检测狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒、其制备方法及检测方法。该试剂盒是将重组狂犬病毒g蛋白作为抗原包被在酶联板上，以辣根过氧化物酶(hrp)标记的鼠抗人igg fc片段单克隆抗体作为酶标记物。所述试剂盒还包括显色剂a、显色剂b、终止液、样品稀释液、阴性对照为正常人血清、阳性对照为含有狂犬病毒抗体的血清。
6、该专利技术采用的是间接elisa法，即将重组狂犬病毒g蛋白作为抗原进行包被，待检测血清先进行反应，如果血清中存在抗体(一抗)，则会与包被抗原发生免疫结合，再加入二抗进行反应，该二抗是针对一抗的，会与已被结合的一抗发生免疫结合，形成抗原-一抗-二抗复合物，而二抗上预先标记了hrp，可通过加入显色试剂进行显色，从而间接反映血清中的一抗的量。但是由于血清中存在的一抗是多克隆抗体，而所使用的二抗并不能针对多克隆抗体中的每一种进行设计，因此该技术使用鼠抗人igg fc片段单克隆抗体作为二抗，无法保证其对血清中所有一抗的完全和正确的识别，可能出现假阳性和假阴性问题，检测质量不准确。
7、中国专利申请文献cn 101936998a公开了犬用抗狂犬病病毒igg抗体试剂盒，试剂盒内：酶标板预先包被抗狂犬病病毒单克隆抗体，封闭完再包被狂犬病毒纯化抗原；酶结合物为辣根过氧化物酶-兔抗犬igg酶结合物。
8、该专利技术采用的是夹心elisa法，即将抗狂犬病病毒单克隆抗体先进行包被，在此基础上进一步通过免疫结合将结合的抗原(重组狂犬病毒疫苗株)包被，作为试剂盒中酶联板提供，待检测血清先进行反应，如果血清中存在抗体(一抗)，则会与包被抗原发生免疫结合，再加入二抗进行反应，该二抗是针对一抗的，会与已被结合的一抗发生免疫结合，形成抗原-一抗-二抗复合物，而二抗上预先标记了hrp，可通过加入显色试剂进行显色，从而间接反映血清中的一抗的量。该技术的不同在于在包被抗原之前先包被了抗狂犬病病毒单克隆抗体，从而形成的是抗体-抗原-一抗-二抗的抗原夹心复合物，对信号放大、检测灵敏度等有一定的改善。但是同样由于血清中存在的一抗是多克隆抗体，而所使用的二抗并不能针对多克隆抗体中的每一种进行设计，因此该技术使用兔抗犬igg抗体作为二抗无法保证其对血清中所有一抗的完全和正确的识别，仍然可能出现假阳性和假阴性问题，检测质量不准确。此外，由于该技术中预先还包被了一层抗狂犬病病毒单克隆抗体，那么该二抗除了识别结合血清中的一抗(已结合到抗原上)，同样可能识别抗原上原本就包被的抗狂犬病病毒单克隆抗体，无形中增加了血清中一抗的存在量。第三，该技术使用的抗原为重组狂犬病毒疫苗株本身作为抗原，其识别特异性和灵敏度方面也存在影响。
9、中国专利文献cn 1547028a公开了用竞争酶联免疫吸附试验检测犬狂犬病毒总抗体试剂盒及制备方法，试剂盒组成为：已预包被狂犬病毒抗原(狂犬病毒疫苗株)的酶标板，酶结合物(hrp-抗狂犬病病毒n蛋白单抗)，阳性血清，阴性血清，浓缩洗涤液，底物，终止液。
10、与间接elisa和夹心elisa检测方法不同，竞争elisa不使用针对一抗的二抗，而是使用两种均可免疫结合抗原的抗体进行竞争性结合(一种抗体源于待检测血清中的抗狂犬病病毒抗体，另一种抗体是酶标记的抗狂犬病病毒抗体)，通过显色信号计算出的阻断率来评价待检测血清中的抗体效价。但该方法使用的抗原为狂犬病毒疫苗株本身作为抗原，其识别特异性和灵敏度方面存在问题；而其使用的竞争性抗体为以狂犬病毒n蛋白为抗原制备获得的单克隆抗体，其特异性识别的是n蛋白，而n蛋白作为狂犬病毒识别抗原的效率是不够的，因此其竞争性结合能力存疑。
11、本专利技术针对上述技术问题，提供一种狂犬病毒中和抗体检测试剂盒制备方法及初步应用。该试剂盒可以在机体接受狂犬疫苗接种后，通过对待测血清的检测，根据阻断率的结果明确是否抗体水平达到0.5iu/ml水平，从而对狂犬疫苗免疫水平进行监测，提示免疫效果，真正评价狂犬疫苗的免疫达到免疫保护，保障犬猫等动物和人类的安全，具有十分良本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种狂犬病毒中和抗体的酶联免疫检测试剂盒，包括狂犬病毒抗原包被的酶联反应板、酶标抗狂犬病病毒单克隆抗体、稀释液、显色试剂和阴性、阳性血清对照；其中所述狂犬病毒抗原为狂犬病毒G抗原，所述试剂盒通过竞争性ELISA计算阻断率来评价血清样品的抗体效价。
2.根据权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述稀释液选自100%正常犬血清、50%正常犬血清、20%正常犬血清、10%正常犬血清、5%正常犬血清、5%BSA的磷酸盐缓冲液或者5%脱脂乳。
3.根据权利要求1或2所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述显色试剂为四甲基联苯胺溶液，所述终止液为硫酸或磷酸溶液。
4.权利要求1-3任一项所述试剂盒的制备方法，其步骤包括：1）酶标抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备：取辣根过氧化物酶（HRP）溶液，加入HRP活化缓冲液和HRP偶联缓冲液进行活化后，加入需偶联的抗狂犬病病毒单克隆抗体，混匀后于4℃透析过夜；透析后加入还原剂完成偶联；2）抗原包被：用ELISA包被液将狂犬病毒G蛋白于4℃包被过夜，弃去包被液；加入洗涤液进行洗涤后，加入封闭液于室温下封闭
5.用于权利要求1-3任一项所述试剂盒的抗狂犬病病毒单克隆抗体，由重链和轻链组成，其中所述重链的可变区包括三个CDR区，其序列分别如SEQ ID NO:1-3所示；且所述轻链的可变区包括三个CDR区，其序列分别如SEQ ID NO:4-6所示。
6.如权利要求5所述的抗狂犬病病毒单克隆抗体，其中所述重链的可变区的全长序列如SEQ ID NO:7所示，且所述轻链的可变区的全长序列如SEQ ID NO:8所示。
7.编码权利要求5或6所述抗体的核酸分子。
8.含有权利要求7所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。
9.权利要求1-3任一项所述酶联免疫检测试剂盒、权利要求5-6任一项所述抗狂犬病病毒单克隆抗体、或者权利要求7所述核酸分子、或者权利要求8所述表达盒、重组载体或重组微生物在评价抗狂犬病病毒血清样品的抗体效价中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种狂犬病毒中和抗体的酶联免疫检测试剂盒，包括狂犬病毒抗原包被的酶联反应板、酶标抗狂犬病病毒单克隆抗体、稀释液、显色试剂和阴性、阳性血清对照；其中所述狂犬病毒抗原为狂犬病毒g抗原，所述试剂盒通过竞争性elisa计算阻断率来评价血清样品的抗体效价。
2.根据权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述稀释液选自100%正常犬血清、50%正常犬血清、20%正常犬血清、10%正常犬血清、5%正常犬血清、5%bsa的磷酸盐缓冲液或者5%脱脂乳。
3.根据权利要求1或2所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述显色试剂为四甲基联苯胺溶液，所述终止液为硫酸或磷酸溶液。
4.权利要求1-3任一项所述试剂盒的制备方法，其步骤包括：1）酶标抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备：取辣根过氧化物酶（hrp）溶液，加入hrp活化缓冲液和hrp偶联缓冲液进行活化后，加入需偶联的抗狂犬病病毒单克隆抗体，混匀后于4℃透析过夜；透析后加入还原剂完成偶联；2）抗原包被：用elisa包被液将狂犬病毒g蛋白于4℃包被过夜，弃去包被液；加入洗涤液进行洗涤...
【专利技术属性】
技术研发人员：葛良鹏，吴梦，刘雪芹，丁玉春，
申请(专利权)人：重庆市畜牧科学院，
类型：发明
国别省市：
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