【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术与家畜育种领域，涉及基因单核苷酸多态性(snp)的检测，特别涉及利用竞争性等位基因特异性pcr(kasp)方法进行快速、精准地检测绵羊gdf9基因的g.42114493snp标记。
技术介绍
1、绵羊作为最早被人类驯化的动物之一，在畜牧产业中具有重要的经济价值，可以为人们提供羊肉、羊奶、羊绒、羊皮等一系列动物副产品。我国是绵羊饲养量、出栏量及羊肉产出量最多的国家，绵羊的繁殖性状会影响养殖企业的生产效益。现代绵羊育种旨在提高其生产性能从而大大提高其经济价值。随着生物科学技术的发展以及遗传学研究的深入，传统的选择方法逐渐暴露出周期长、难度大等弊端，已不能满足我国绵羊育种能力快速提高的需要。近年来，分子标记辅助选择(marker-assisted selection，mas)在动物育种中广为应用，可以显著提高选择的准确性和选择效率。分子标记辅助选择可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，进行分子育种。
2、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,snp)指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性。利用snp分析个体基因组，可以更好地解释个体的表型差异，在动物分子育种中具有重要意义。snp遍布于整个基因组，其中大部分位于已知的基因区域内，还有一些位于决定基因功能的关键性区域，如启动子区和外显子区等。常见的snp检测方法包括：测序法、酶切法、基因芯片法、snpshot、kasp(kompetitiveallele sp
3、gdf9基因(growth differentiation factor 9)于最早首次在小鼠卵巢中发现(mcpherron and lee 1993)，它是bmp15的同源基因。gdf9也在卵母细胞中表达，其产物可以形成非共价异型二聚体，对周围卵泡颗粒细胞的功能产生协同作用(yan et al.2001)。gdf9由卵泡特异性分泌，也是卵母细胞分泌的重要调节因子，与bmp15蛋白一起作为旁分泌因子调节颗粒细胞的增殖和分化，并可通过控制关键酶使卵丘细胞扩大，这表明gdf9基因在卵巢卵泡的生长分化过程中起着至关重要的作用(combelles 2013；peng et al.2013)。在初级卵泡阶段观察到卵母细胞中gdf9基因的表达，并持续到排卵，在绵羊的卵巢卵泡和黄体最的各个阶段都检测到了gdf9 mrna和蛋白的表达(dube et al.1998)。另外，gdf9基因还可以刺激或降低其受体基因的表达水平，如fsh受体(fshr)和lh受体(lhr)，用于卵母细胞获得抗闭锁和发育能力(otsuka et al.2011)。并且它在排卵前卵泡生长的最后阶段也起着重要作用，在促黄体生成素激增前，卵丘细胞需要gdf9来支持代谢级联反应，例如糖酵解和甾醇生物合成(sugiura et al.2005)。gdf9突变主要影响母羊卵泡和卵母细胞数量(al-mutar and younis,2020)，dong等(1996)研究发现该基因的缺失会导致卵泡受阻和完全不育，这是由于卵巢被异常卵泡占据，单层颗粒细胞排列不对称，卵泡膜细胞层在初级单层卵泡中明显缺失。目前也在gdf9基因发现到一系列可能影响绵羊产羔的重要突变位点，包括fecgh、fecgt、fecge、fecgf和fecgv，其中fecgh、fecgt和fecgv突变可以增加排卵率，fecge和fecgf突变对排卵和产羔数具有累加效应(souza et al.2014；wang et al.2021)。hanrahan等研究发现gdf9基因的8个突变，分别是g1-g8，其中包括g1、g4、g6、g7和g85个错义突变以及g2、g3和g53个同义突变，发现gdf9基因突变会影响排卵并对正常卵泡发生至关重要(hanrahan et al.2004)。有研究在gdf9基因-725至-309bp启动子区域检测到-332c/t、-407t/g和-534a/g三个完全连锁的snps，产生三种基因型(即aa、ab和bb)，并且关联分析表明aa基因型母羊的平均产羔数大于bb基因型母羊；位于启动子区域的-534a/g突变会产生一个新的有机阳离子转运蛋白1(oct1)转录因子结合位点，并通过直接与-534gg基因型结合并与c/ebp形成复合物来抑制启动子活性，进而促进绵羊卵巢颗粒细胞凋亡，从而影响窝产羔数(li et al.2020b)。目前尚未见到有关在绵羊gdf9基因的nc_056058.1:g.42114493snp位点上进行kasp检测的报道。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种利用kasp快速检测绵羊繁殖相关gdf9基因单核苷酸多态性的方法。
2、为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：
3、一种利用kasp快速检测绵羊繁殖相关gdf9基因单核苷酸多态性(nc_056058.1:g.42114493snp)的方法，该检测绵羊gdf9基因的nc_056058.1:g.42114493单核苷酸多态性的方法包括以下步骤：
4、以待测绵羊个体全基因组dna为模板，通过引物混合物扩增包含g.42114493单核苷酸多态性位点的gdf9基因部分片段；根据荧光类型和强度的分析结果鉴定个体在该nc_056058.1:g.42114493单核苷酸多态性位点的基因型；
5、所述gdf9基因的g.42114493单核苷酸多态性位点为定位于绵羊参考序列nc_056058.1:g.42114493的c>t变异位点；
6、优选的，所述引物混合物包括由上游分型引物fam、上游分型引物vic和下游引物r组成的kasp引物：
7、上游分型引物fam：
8、5’-gaaggtgaccaagttcatgctcactcagattgactgaagctggaac-3’；
9、上游分型引物vic：
10、5’-gaaggtcggagtcaacggattcactcagattgactgaagctggaat-3’；
11、下游引物r：
12、5’-gaagctgctgagggtgtaagatcgtcccg-3’。
13、优选的，所述检测绵羊繁殖相关gdf9基因的nc_056058.1:g.42114493单核苷酸多态性的方法中，kasp反应体系包括待测绵羊个体全基因组dna以及本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测绵羊繁殖相关GDF9基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述一种快速检测绵羊繁殖相关GDF9基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述引物为KASP引物，KASP引物为：
3.根据权利要求1所述一种检测绵羊繁殖相关GDF9基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述KASP采用的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，61℃退火1min，共10个循环，每个循环后退火温度降低0.6℃；95℃变性15s，55℃退火1min，共30个循环。
4.根据权利要求2所述一种快速检测绵羊繁殖相关GDF9基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述基因型的鉴定具体包括以下步骤：根据与KASP引物带有的接头序列匹配的不同类型荧光的强度对NC_056058.1:g.42114493单核苷酸多态性位点的CC、CT、TT三种基因型进行分型。
【技术特征摘要】
1.一种检测绵羊繁殖相关gdf9基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述一种快速检测绵羊繁殖相关gdf9基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述引物为kasp引物，kasp引物为：
3.根据权利要求1所述一种检测绵羊繁殖相关gdf9基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于：所述kasp采用的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，61℃...
【专利技术属性】
技术研发人员：蓝贤勇，竺蕾静，朱琦慧，任稳稳，刘沛尧，潘传英，曹春娜，潘晔君，张清峰，杜书增，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：
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