【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学分子标记，特别是涉及一种利用est-ssr引物鉴定玄参品种的方法。
技术介绍
1、玄参(scrophularia ningpoensis hemsl.)为玄参科(scrophulariaceae)玄参属(scrophularia)的高大草本，以根入药，具滋阴降火、消肿解毒等功效。玄参是我国传统的大宗药材，已有2000多年的应用历史，主产浙江、湖南、湖北、贵州、四川、重庆、陕西等地。随着引种肯驯化不同产区独立形成了适应当地产区环境特有种源。但是随着中药材产业发展，在种苗不足时，不同产区间出现相互引种现象，高海拔产区(西南产区)的种源引种到浙江低海拔产区，会导致块根发育不良和活性成分大幅度改变。盲目的引种不利于道地产区药材品质的稳定。目前仅凭外观形态来对不同种源玄参进行区分，主要通过对其叶片类型，花序形态，果实数量、大小，茎秆颜色，分枝数量、长短等外观形态进行判断。以花果等外观形态区分玄参种源受植株发育状态限制，尤其在玄参幼苗期很难有效可靠的进行区分，如果等到种植的玄参开花结果后才发现不是想要的种源，势必会造成极大的损失。
2、种质鉴定方法有很多，如形态特征鉴定法、孢粉超微结构鉴定法、同工酶分析法、分子标记技术等。分子标记技术以其快速准确、多态性高、直接以dna形式表现、不受外界环境及组织类别和发育时期的影响等优越性成为目前最受青睐的鉴定方法。相对于表型性状鉴定法，dna分子标记技术对玄参的种源区分更为准确有效，且突破了判断时间的限制，为玄参全生育期期的鉴定提供了准确可靠的方法。
3、
4、ssr分子标记(simple sequence repeats)即简单序列重复，也称微卫生标记，是近年发展起来的建立在pcr基础上的第二代分子标记。微卫星在原核生物和真核生物基因组中随机分布，而且该标记呈共显性，符合孟德尔遗传模式，易于操作，具有高度重复性和可靠性，显示出较强的多态性等优点，使其在品种鉴定上得到广泛应用。然而，目前还没有有效的玄参品种的分子鉴定方法，故需建立一种快速、准确鉴定玄参品种的分子手段。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服上述现有技术的缺点，本专利技术的一方面提供一种利用est-ssr引物鉴定玄参品种的方法，能够对不同种源玄参进行快速、有效的鉴定。本方法采用的是普通引物进行扩增并用琼脂糖凝胶电泳进行检测，与荧光标记引物的毛细管电泳检测方法相比更经济实惠易于操作。
2、为了达到上述的目的，本专利技术的具体技术方案如下：
3、一种用于鉴定玄参品种的est-ssr引物，包括8对引物，分别为：y38、y3、y17、y65、y68、y127、y11、y139，序列如下：
4、y38-f：ggaggaagtgttgactagcgg，
5、y38-r：actaggtattcggtgcccaaa；
6、y3-f：cagtggtaaatctccaggcat，
7、y3-r：ctttgctttctcttttatggc；
8、y17-f：cgcaaaatctggacaactatg，
9、y17-r：agattagcgaaatgggatacg；
10、y65-f：tctttttccccttcatttctc，
11、y65-r：ccagacatctcactatgcttg；
12、y68-f：ctcttttccaggagggacagt，
13、y68-r：catcaccgccattattaccac；
14、y127-f：gatgaggatgttgtggagaata，
15、y127-r：ctttctcttcctcacgctctt；
16、y11-f：ttacaaaggtgagtttcggtg，
17、y11-r：tactcaacaaacccgacagat；
18、y139-f：tcccttcaggtatttgatgtg，
19、y139-r：cagacatctcactatgcttgct。
20、本专利技术还提供了所述est-ssr引物在鉴定玄参品种中的应用。
21、本专利技术还提供了一种用于鉴定玄参品种的试剂盒，包括所述est-ssr引物。
22、本专利技术还提供了一种利用est-ssr引物鉴定玄参品种的方法，包括以下步骤：
23、(1)提取待鉴定样品的dna；
24、(2)以步骤(1)所得dna作为模板，使用所述用于鉴定玄参品种的est-ssr引物进行pcr扩增，得到扩增产物；
25、(3)将步骤(2)所得扩增产物进行电泳检测，检测扩增产物的带型，与已知玄参品种的标准带型进行比对，8个位置的带型全部相同的为同一玄参品种，从而确定待鉴定样品的品种。
26、优选的，步骤(2)检测时，每对引物单独检测一次。
27、具体的，每对引物单独检测时，pcr扩增的体系为：1μl模板，6μl的2×hieffpcrmaster，1μl上游引物f，1μl下游引物r，1μl的ddh2o。
28、每对引物单独检测时，pcr扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环；72℃延伸10min；4℃保持。
29、本专利技术还提供了一种利用est-ssr引物分析玄参品种种源远近的方法，包括以下步骤：
30、(1)提取待分析各样品的dna；
31、(2)以步骤(1)所得各dna作为模板，使用所述用于鉴定玄参品种的est-ssr引物进行pcr扩增，得到扩增产物；
32、(3)将步骤(2)所得扩增产物进行电泳检测，检测扩增产物的带型，将待分析各样品的带型进行比较，8个位置的带型相差数量越少表示待分析的玄参品种之间的种源关系越近，8个位置的带型相差数量越多表示待分析的玄参品种之间的种源关系越远。
33、优选的，步骤(2)检测时，每对引物单独检测一次。
34、具体的，每对引物单独检测时，pcr扩增的体系为：1μl模板，6μl的2×hieff pcrmaster，1μl上游引物f，1μl下游引物r，1μl的ddh2o；
35、每对引物单独检测时，pcr扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于鉴定玄参品种的EST-SSR引物，其特征在于，包括8对引物，分别为：Y38、Y3、Y17、Y65、Y68、Y127、Y11、Y139，序列如下：
2.权利要求1所述EST-SSR引物在鉴定玄参品种中的应用。
3.一种用于鉴定玄参品种的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述EST-SSR引物。
4.一种利用EST-SSR引物鉴定玄参品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述利用EST-SSR引物鉴定玄参品种的方法，其特征在于，步骤(2)检测时，每对引物单独检测一次。
6.根据权利要求5所述利用EST-SSR引物鉴定玄参品种的方法，其特征在于，每对引物单独检测时，PCR扩增的体系为：1μL模板，6μL的2×HieffPCR Master，1μL上游引物F，1μL下游引物R，1μL的ddH2O。
7.根据权利要求5所述利用EST-SSR引物鉴定玄参品种的方法，其特征在于，每对引物单独检测时，PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s
8.一种利用EST-SSR引物分析玄参品种种源远近的方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述利用EST-SSR引物分析玄参品种种源远近的方法，其特征在于，步骤(2)检测时，每对引物单独检测一次。
10.根据权利要求9所述利用EST-SSR引物分析玄参品种种源远近的方法，其特征在于，每对引物单独检测时，PCR扩增的体系为：1μL模板，6μL的2×Hieff PCR Master，1μL上游引物F，1μL下游引物R，1μL的ddH2O；
...【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定玄参品种的est-ssr引物，其特征在于，包括8对引物，分别为：y38、y3、y17、y65、y68、y127、y11、y139，序列如下：
2.权利要求1所述est-ssr引物在鉴定玄参品种中的应用。
3.一种用于鉴定玄参品种的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述est-ssr引物。
4.一种利用est-ssr引物鉴定玄参品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述利用est-ssr引物鉴定玄参品种的方法，其特征在于，步骤(2)检测时，每对引物单独检测一次。
6.根据权利要求5所述利用est-ssr引物鉴定玄参品种的方法，其特征在于，每对引物单独检测时，pcr扩增的体系为：1μl模板，6μl的2×hieffpcr master，1μl上游引物f，1μl下游引物...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙健，姚辉，王志安，
申请(专利权)人：浙江省中药研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：
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