【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及类器官培养领域，具体涉及一种瘢痕疙瘩类器官培养基及培养方法。
技术介绍
1、类器官(organoids)是一种由多细胞构成的复杂三维结构体系，可在体外表现出与体内细胞相似的遗传特征和结构稳定性，并可以被顺利诱导为具有功能的组织细胞。肿瘤类器官是将患者来源的新鲜组织体外3d培养成与体内肿瘤组织病理特征相似、遗传背景相近、能稳定传代的活组织。与动物模型相比，肿瘤类器官培养体系具有更简便、成本低、周期短、通量高等特点，在临床肿瘤精准用药、新药研发、再生医学和基础研究中具有广泛应用和发展前景，从根本上引领肿瘤精准治疗理念的实施。
2、瘢痕疙瘩是一种以侵袭性生长为特点的良性肿瘤，是由于皮肤创伤愈合过程中，成纤维细胞过度增殖、细胞外基质中胶原过度沉积而形成，最常见的好发部位是前胸部、肩部、上背部和耳垂，表现为坚硬、有光泽、有弹性的病变，通常伴有瘙痒、疼痛、毁容和关节挛缩。瘢痕疙瘩可能导致严重的功能和心理后遗症，影响患者的生活质量。瘢痕疙瘩的主要治疗方法是在病灶内注射皮质类固醇，其他治疗方式包括冷冻疗法、5-氟尿嘧啶、放射疗法、激光疗法、手术切除或硅封闭敷料，注射皮质类固醇可作为单一疗法或与其他治疗方式联合使用。由于瘢痕疙瘩的发病机制十分复杂，尽管有多种治疗方案，但治疗效果往往不尽人意，复发率高达45％–100％。因此，建立瘢痕疙瘩类器官的培养对治疗药物筛选和科学研究具有重要意义。
3、虽然现已有多种类器官培养基及类器官培养方法，比如胃癌类器官培养基及培养方法，但是不同的类器官所需的培养基及适用的培养方法
技术实现思路
1、专利技术目的：本专利技术提供了一种用于瘢痕疙瘩类器官的培养基和培养方法。本专利技术的培养基基针对瘢痕疙瘩组织来源细胞的生长特点，能够成功培养出瘢痕疙瘩类器官；本专利技术的培养方法包括瘢痕疙瘩类器官的建立方法、传代、冻存、复苏，该方法培养可操作性好，能够成功培养瘢痕疙瘩类器官并传代，可以在有限时间内获得足量类器官开展科学研究并保存样本。
2、
技术实现思路
：一种瘢痕疙瘩类器官培养基，所述瘢痕疙瘩类器官培养基包括基础培养基advanced dmem/f12及特异性添加因子，所述特异性添加因子包括以下成分：primocin、hepes、glutamax、b-27无血清添加剂、n-acetyl-l-cysteine、megf、hfgf10、hr-spondin 1、afamin-wnt3a和nicotinamide。
3、优选的，所述特异性添加因子中各成分在瘢痕疙瘩类器官培养基中的终浓度如下：
4、primocin，0.5～5×；
5、hepes，1～100mm；
6、glutamax，0.2～20mm；
7、b-27无血清添加剂，0.5～10×；
8、n-acetyl-l-cysteine，0.1～200mm；
9、megf，1～300ng/ml；
10、hfgf10，1～500ng/ml；
11、hr-spondin 1，0.1～50mg/ml；
12、afamin-wnt3a，5～50％体积浓度；
13、nicotinamide，0.1～200mm。
14、优选的，所述特异性添加因子中各成分在瘢痕疙瘩类器官培养基中的浓度如下：
15、primocin，1×；
16、hepes，10mm；
17、glutamax，2mm；
18、b-27无血清添加剂，1×；
19、n-acetyl-l-cysteine，1mm；
20、megf，50ng/ml；
21、hfgf10，200ng/ml；
22、hr-spondin 1，1mg/ml；
23、afamin-wnt3a，25％体积浓度；
24、nicotinamide，10mm。
25、本专利技术提供了一种瘢痕疙瘩类器官的建立方法，包括如下步骤：
26、步骤一、将瘢痕疙瘩组织预处理得到瘢痕疙瘩细胞；
27、步骤二、建立瘢痕疙瘩类器官；将瘢痕疙瘩细胞与基质胶混合，置于37℃，5％co2细胞培养箱中，待基质胶凝固后，加入瘢痕疙瘩类器官培养基，再次置于37℃，5％co2细胞培养箱培养，每隔4天换一次培养基，培养4天-28天后得到瘢痕疙瘩类器官。
28、进一步的，步骤一中，瘢痕疙瘩组织预处理步骤如下：
29、1)取瘢痕疙瘩组织，用pbs清洗后去除脂肪，并切下绿豆大小的组织块，再次用pbs清洗至少2次后用pbs浸泡3-5min，弃去pbs；
30、2)用双抗浸泡组织块3-5min，弃去双抗；
31、3)在平皿中将组织块用组织消化液润湿后切碎，用组织消化液将所有组织块移入离心管中，37℃摇床消化15～60min；
32、4)用移液枪吹打混匀后静置，取上清液至离心管中加入wash终止消化，离心后弃去上清，得到的细胞沉淀，即为瘢痕疙瘩细胞。
33、进一步的，步骤二中建立瘢痕疙瘩类器官的具体操作如下：
34、1)取出基质胶置于冰上，用移液枪取基质胶与瘢痕疙瘩细胞充分混合后，置于冰上；
35、2)实验前将孔板置于37℃细胞培养箱升温至少30min，接种前取出预热好的孔板，在每孔的孔中央滴加50μl混合有细胞的基质胶，置于37℃，5％co2细胞培养箱中15min，待基质胶凝固后，每孔加500μl瘢痕疙瘩类器官培养基，再次置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养，4天换一次培养基，培养4-28天后得到瘢痕疙瘩类器官。
36、本专利技术提供了一种瘢痕疙瘩类器官传代培养方法，包括如下步骤：
37、1)取培养4-28天后得到的瘢痕疙瘩类器官孔板，吸弃孔内的培养基，用基质胶消化液吹打，待基质胶全部融化后，转移至离心管中，37℃水浴消化5min后，1400rpm离心5min，吸弃上清；
38、2)向离心管中加入tryple express酶重悬细胞；将离心管置于37℃水浴消化5min，消化结束后加入与tryple express酶等体积的wash终止消化，1400rpm离心5min弃去上清，得到细胞沉淀；
39、3)取出基质胶置于冰上，吸取基质胶加入到细胞沉淀中吹打混匀，得到混有细胞的基质胶；
40、4)实验前将孔板置于37℃细胞培养箱升温至少30min，接种前取出预热好的孔板，将50μl混有细胞的基质胶滴入孔板的孔中央，37℃固化15min；基质胶凝固后，向孔中加入500μl瘢痕疙瘩类器官培养基，置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养，每4天换一次培养基。
41、本专利技术提供了一种瘢痕疙瘩类器官冻存方法，包括如下步骤：
42、1)取培养本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种瘢痕疙瘩类器官培养基，其特征在于，所述瘢痕疙瘩类器官培养基包括基础培养基advanced DMEM/F12及特异性添加因子，所述特异性添加因子包括以下成分：primocin、HEPES、GlutaMAX、B-27无血清添加剂、N-acetyl-L-cysteine、mEGF、hFGF10、hR-spondin 1、Afamin-Wnt3A和Nicotinamide。
2.根据权利要求1所述的一种瘢痕疙瘩类器官培养基，其特征在于，所述特异性添加因子中各成分在瘢痕疙瘩类器官培养基中的终浓度如下：
3.根据权利要求1所述的一种瘢痕疙瘩类器官培养基，其特征在于，所述特异性添加因子中各成分在瘢痕疙瘩类器官培养基中的浓度如下：
4.一种瘢痕疙瘩类器官的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的一种瘢痕疙瘩类器官的建立方法，其特征在于，步骤一中，瘢痕疙瘩组织预处理步骤如下：
6.根据权利要求5所述的一种瘢痕疙瘩类器官的建立方法，其特征在于，步骤二中，建立瘢痕疙瘩类器官的具体操作如下：
7.一种瘢
8.一种瘢痕疙瘩类器官冻存方法，其特征在于，包括如下步骤：
9.一种瘢痕疙瘩类器官复苏方法，其特征在于，包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种瘢痕疙瘩类器官培养基，其特征在于，所述瘢痕疙瘩类器官培养基包括基础培养基advanced dmem/f12及特异性添加因子，所述特异性添加因子包括以下成分：primocin、hepes、glutamax、b-27无血清添加剂、n-acetyl-l-cysteine、megf、hfgf10、hr-spondin 1、afamin-wnt3a和nicotinamide。
2.根据权利要求1所述的一种瘢痕疙瘩类器官培养基，其特征在于，所述特异性添加因子中各成分在瘢痕疙瘩类器官培养基中的终浓度如下：
3.根据权利要求1所述的一种瘢痕疙瘩类器官培养基，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：王守宇，张孝宁，李晓月，周炳荣，崔晓美，
申请(专利权)人：赛领生物科技南京有限公司，
类型：发明
国别省市：
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