【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及转录调节物多肽，编码这些转录调节物多肽的多核苷酸，以及涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及在过表达这些转录调节物的宿主细胞中生产目的多肽的方法，涉及在真菌宿主细胞培养过程中增加培养液的氧摄取率和/或降低培养液的粘度的方法，涉及生产转录调节物多肽的方法，涉及转录调节物多肽的用途，以及涉及真菌生物质的生产。
技术介绍
1、重组真菌宿主细胞如里氏木霉由于其分泌大量纤维素酶和其他蛋白质的优异能力而在工业上得到广泛应用。在真菌宿主细胞系统中产生的重组蛋白通常是有价值的蛋白，例如重组产生的葡糖淀粉酶，其中宿主细胞和生产方法如wo 2011127802中所述。对于工业和商业目的，所用细胞系统的生产率(即每个发酵单位的总蛋白质产量)是生产成本的重要因素。其他有利因素是培养液粘度低、与产物形成相关的生物质生成减少以及氧摄取率增加从而增加产物形成。传统上，产率的增加是通过诱变和筛选产量增加的目的蛋白来实现的。然而，该方法主要仅可用于在含有目的酶的分离物中过量生产内源蛋白。因此，对于每种新的蛋白质或酶产品，都需要漫长的菌株和工艺开发计划来实现生产率的改善。
2、对于异源蛋白在真菌宿主细胞系统中的过量表达，生产过程被认为是一个复杂的多阶段和多组分过程。细胞生长和产物形成由多种参数，培养物粘度决定，包括培养基的组成、培养液粘度、发酵ph值、温度、溶解氧张力、剪应力和真菌形态。一般来说，氧传递和氧摄取受发酵液中细胞的存在的影响。效果取决于生物体的形态和细胞浓度。具有复杂形态的细胞，例如真菌细胞的分枝菌丝，通常会通
3、已经在真菌中使用了多种改善表达和分泌的方法。对于异源基因的表达，密码子优化的合成基因可以提高转录率，而分泌伴侣(secretion chaperone)的过量表达用于保护异源蛋白不被降解。为了获得特定基因的高水平表达，一项成熟的程序是使重组基因构建体的多个拷贝靶向高表达内源基因的基因座。wo 2011/075677(诺维信公司(novozymesa/s))中描述了通过破坏原初蛋白酶来提高蛋白质产率的另一策略。此外，人们正在进行广泛的努力来了解控制内源真菌基因表达的复杂调节网络，包括如wo 2017144777中所述的合成启动子和合成表达系统的设计。
4、尽管讨论了这些方法，但进一步提高真菌宿主细胞中的重组蛋白产量仍是持续感兴趣的。本专利技术的目的是提供经修饰的宿主菌株和具有增加的蛋白质生产率和/或具有有利的培养特性的蛋白质生产方法。
技术实现思路
1、本专利技术基于出人意料和创造性的发现，即真菌转录调节物多肽的过表达导致宿主细胞蛋白质产生和分泌增加，以及目的重组蛋白质的产生和分泌增加。此外，本专利技术人出人意料地发现，当在需氧发酵条件下培养时，真菌转录调节物多肽的过表达导致培养液具有增加的氧摄取率和/或降低的粘度。鉴定的调节多肽用于在真菌宿主细胞例如木霉属宿主细胞中生产重组多肽和/或宿主细胞蛋白的方法中，但也可应用于体外转录调节，例如在无细胞系统或其他蛋白质表达平台中。此外，鉴定的调节多肽还用于蛋白质生产的方法中，其中产生的培养液具有增加的氧摄取率和/或降低的粘度。描述了编码转录调节物多肽的新颖多核苷酸，以及使用所述多核苷酸产生异源和原初蛋白质的方法。
2、如实例中所述，专利技术人已鉴定真菌转录调节物多肽的过表达出人意料地导致总宿主细胞蛋白和不同类别的目的蛋白的产率和/或分泌增加。因此，我们期望这些发现也适用于其他目的蛋白质，例如其他糖蛋白，特别是其他异源蛋白质。另外，完全出乎意料的是，其调节多肽的过表达导致氧摄取速率增加和/或培养液粘度降低，这有利于高蛋白质产率/生物质。进一步出乎意料的观察是所述调节多肽的过表达导致真菌生物质形成增加。转录调节物多肽的氨基酸序列的序列分析揭示该多肽包含至少一个代表该多肽的dna结合基序的锌指结构域。假定所述至少一个结构域对上述培养和蛋白质表达中的积极作用有显著贡献。
3、因此，在第一方面，本专利技术涉及真菌宿主细胞，其在其基因组中包含至少一个第一异源启动子，该第一异源启动子可操作地连接至编码真菌转录调节物多肽或其变体的第一多核苷酸，该真菌转录调节物多肽或其变体包含以下或由以下组成：与seq id no:24具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。
4、相对于缺乏与第一多核苷酸可操作地连接的所述第一异源启动子的等基因或亲本真菌宿主细胞，第一多核苷酸的存在导致真菌宿主细胞中真菌转录调节物多肽或其变体的水平增加。在需氧发酵条件下培养时，相对于缺乏可操作地连接到第一多核苷酸的所述第一异源启动子的等基因或亲本真菌宿主细胞，由第一多核苷酸编码的调节多肽或其变体的表达增加有利于宿主细胞蛋白质生产和/或分泌的增加、目的蛋白质生产和/或分泌的增加、培养液粘度的降低、总补料量的增加和/或培养液氧摄取率的增加。
5、在第二方面，本专利技术涉及一种用于生产至少一种目的多肽的方法，该方法包括：
6、i)提供根据第一方面的真菌宿主细胞，
7、ii)在有助于该至少一种目的多肽表达的条件下培养所述真菌宿主细胞；以及
8、iii)任选地，回收该至少一种目的多肽。
9、在所述第二方面的生产方法中利用第一方面的宿主细胞，至少一种重组目的蛋白和/或至少一种原初宿主细胞目的蛋白可以在所述宿主细胞中表达和分泌，且产率相对于缺乏与第一多核苷酸可操作地连接的所述第一异源启动子的等基因或亲本真菌宿主细胞增加。该方法还允许同时表达和分泌两种或更多种目的蛋白质，例如三种、四种或更多种目的蛋白质。此外，该方法允许在低培养液粘度水平下发酵，导致氧摄取率增加，这可能是允许本专利技术的宿主细胞增加蛋白质产生和/或分泌的因素之一。
10、在第三方面，本专利技术涉及核酸构建体，其包含与编码真菌转录调节物多肽或其变体的第一多核苷酸可操作地本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种真菌宿主细胞，其在其基因组中包含与编码真菌转录调节物多肽或其变体的第一多核苷酸可操作地连接的至少一个第一异源启动子，该真菌转录调节物多肽或其变体包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:24具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的真菌宿主细胞，其中该转录调节物多肽或其变体对于该宿主细胞是内源的。
3.如权利要求1至2中任一项所述的真菌宿主细胞，其中该转录调节物多肽或其变体包含至少一个DNA结合基序，该DNA结合基序包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:79或SEQID NO:80具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
4.如权利要求1至3中任一项所述的真菌宿主细胞，其中该转录调节物多肽或其变体包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:24具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％
5.如前述权利要求中任一项所述的真菌宿主细胞，其在其基因组中包含至少一个第二异源启动子，该第二异源启动子可操作地连接至编码至少一种目的多肽的至少一个第二多核苷酸，优选地该至少一种目的多肽被分泌。
6.如前述权利要求中任一项所述的真菌宿主细胞，其中可操作地连接至该第一多核苷酸的第一异源启动子对于该宿主细胞而言是内源的。
7.如前述权利要求中任一项所述的真菌宿主细胞，其中该宿主细胞是丝状真菌宿主细胞；优选地，该丝状真菌宿主细胞选自由以下组成的组：枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉酵母属、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属、和木霉属细胞；更优选地，该丝状真菌宿主细胞选自由以下组成的组：泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌、干拟蜡菌、卡内基拟蜡菌、浅黄拟蜡菌、潘诺希塔拟蜡菌、环带拟蜡菌、微红拟蜡菌、虫拟蜡菌、狭边金孢子菌、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌、粪状金孢子菌、毡金孢子菌、昆士兰金孢子菌、热带金孢子菌、带纹金孢子菌、灰盖鬼伞、毛革盖菌、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射脉菌、刺芹侧耳、土生梭孢壳、长域毛栓菌、变色栓菌、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、和绿色木霉细胞；甚至更优选地，该丝状宿主细胞选自由米曲霉、镶片镰孢和里氏木霉细胞组成的组；最优选地，该丝状真菌宿主细胞是里氏木霉细胞。
8.如权利要求1至7中任一项所述的真菌宿主细胞，其中该宿主细胞是酵母宿主细胞；优选地，该酵母宿主细胞选自由以下组成的组：假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属(驹形氏酵母属)、酵母属、裂殖酵母属、和耶氏酵母属细胞；更优选地，该酵母宿主细胞选自由以下组成的组：乳酸克鲁维酵母、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、和解脂耶氏酵母细胞，最优选地，该酵母宿主细胞是毕赤酵母(法夫驹形氏酵母)。
9.如权利要求5至8中任一项所述的真菌宿主细胞，其中该至少一种目的多肽包含含血红素多肽、布拉齐因、酪蛋白、马铃薯糖蛋白、卵清蛋白、骨桥蛋白、卵转铁蛋白、卵粘蛋白、卵类粘蛋白、卵固蛋白、乳铁蛋白、α-乳清蛋白、β-乳清蛋白、糖巨肽、胶原蛋白和/或治疗性多肽。
10.如权利要求5至8中任一项所述的真菌宿主细胞，其中该至少一种目的多肽选自由以下组成的组：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、溶菌酶、氧化还原酶或转移酶；更优选地是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、核酸酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷酸二酯酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、和β-木...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种真菌宿主细胞，其在其基因组中包含与编码真菌转录调节物多肽或其变体的第一多核苷酸可操作地连接的至少一个第一异源启动子，该真菌转录调节物多肽或其变体包含以下或由以下组成：与seq id no:24具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的真菌宿主细胞，其中该转录调节物多肽或其变体对于该宿主细胞是内源的。
3.如权利要求1至2中任一项所述的真菌宿主细胞，其中该转录调节物多肽或其变体包含至少一个dna结合基序，该dna结合基序包含以下或由以下组成：与seq id no:79或seqid no:80具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
4.如权利要求1至3中任一项所述的真菌宿主细胞，其中该转录调节物多肽或其变体包含以下或由以下组成：与seq id no:24具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。
5.如前述权利要求中任一项所述的真菌宿主细胞，其在其基因组中包含至少一个第二异源启动子，该第二异源启动子可操作地连接至编码至少一种目的多肽的至少一个第二多核苷酸，优选地该至少一种目的多肽被分泌。
6.如前述权利要求中任一项所述的真菌宿主细胞，其中可操作地连接至该第一多核苷酸的第一异源启动子对于该宿主细胞而言是内源的。
7.如前述权利要求中任一项所述的真菌宿主细胞，其中该宿主细胞是丝状真菌宿主细胞；优选地，该丝状真菌宿主细胞选自由以下组成的组：枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉酵母属、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属、和木霉属细胞；更优选地，该丝状真菌宿主细胞选自由以下组成的组：泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌、干拟蜡菌、卡内基拟蜡菌、浅黄拟蜡菌、潘诺希塔拟蜡菌、环带拟蜡菌、微红拟蜡菌、虫拟蜡菌、狭边金孢子菌、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌、粪状金孢子菌、毡金孢子菌、昆士兰金孢子菌、热带金孢子菌、带纹金孢子菌、灰盖鬼伞、毛革盖菌、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙...
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