【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、补体系统包括经典途径、旁路途径和凝集素途径，并且由多种调控因子和组分紧密控制。一种这样的组分是补体因子b(在本文中可互换地称为cfb、因子b、fb)，其是作为单链多肽在血液中循环的丝氨酸蛋白酶酶原。当因子b与c3的活性形式诸如表面结合的c3b或流体相c3(h2o)缔合以形成转化酶原复合物时，因子b可随后被因子d切割成两个片段ba和bb。因子d靶向的因子b的切割位点包括arg234-lys235键。所得的ba切割产物是非催化的并且从复合物中释放，而所得的bb切割产物是催化性丝氨酸蛋白酶，其然后可以将c3切割成c3a和c3b。这种c3b的产生是补体系统扩增环的一部分，从而允许c3b结合另一种因子b以形成c3bbb。
2、因子b及其切割产物调控补体激活。调控异常的补体与涉及补体系统的疾病有关，因此需要用于调节或抑制补体系统内的特定调控点(诸如无活性因子b片段的产生)的方法。本文提供了满足这些需求的组合物和方法。
技术实现思路
1、本文提供了经工程化的、非天然存在的胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。本文还提供了制备和使用此类非天然存在的胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的方法。本文提供的工程化蛋白酶可用于治疗与补体系统的调控异常或补体的过度激活相关的疾病或病症。
2、因此，在一个方面，本文提供了s1a丝氨酸蛋白酶家族的工程化蛋白酶，其中该工程化蛋白酶对于切割因子b具有特异性并且能够切割因子b。更具体地，本公开的工程化蛋白酶包含经修饰的糜酶蛋白酶结构域、经修饰的膜型
3、在一些实施方案中，工程化蛋白酶基于mtsp-1蛋白酶结构域。在一些实施方案中，工程化蛋白酶不基于mtsp-1蛋白酶结构域。在一些实施方案中，工程化蛋白酶相对于包含如seq id no:7所示的氨基酸序列的mtsp-1蛋白酶结构域包含一个或多个修饰。在一些实施方案中，所述一个或多个修饰选自表5a中所示的那些。在一些实施方案中，所述一个或多个修饰选自表5b中所示的那些示例性突变串。在一些实施方案中，工程化蛋白酶包含与seqid no:7具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少95％序列同一性的经修饰的膜型丝氨酸蛋白酶1(mtsp-1)蛋白酶结构域。
4、在一些实施方案中，工程化蛋白酶基于upa蛋白酶结构域。在一些实施方案中，工程化蛋白酶不基于upa蛋白酶结构域。在一些实施方案中，工程化蛋白酶相对于包含如seqid no:22所示的氨基酸序列的upa蛋白酶结构域包含一个或多个修饰。在一些实施方案中，所述一个或多个修饰选自表3a中所示的那些。在一些实施方案中，所述一个或多个修饰选自表3b中所示的那些示例性突变串。在一些实施方案中，工程化蛋白酶包含与seq id no:22具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少95％序列同一性的经修饰的尿激酶型纤溶酶原激活物(upa)蛋白酶结构域。
5、在一些实施方案中，工程化蛋白酶相对于包含如seq id no:6所示的氨基酸序列的糜酶蛋白酶结构域包含一个或多个修饰。在一些实施方案中，所述一个或多个修饰选自表7a中所示的那些。在一些实施方案中，所述一个或多个修饰选自表7b中所示的那些示例性突变串。在一些实施方案中，工程化蛋白酶包含与seq id no:6具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少95％序列同一性的经修饰的糜酶蛋白酶结构域。
6、在一些实施方案中，工程化蛋白酶基于klk5蛋白酶结构域，其任选地包含seq idno:23的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，工程化蛋白酶包含与seq id no:23具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少95％序列同一性的经修饰的激肽释放酶相关肽酶5(klk5)蛋白酶结构域。
7、在一些实施方案中，通过工程化蛋白酶切割因子b产生一种或多种在功能上无活性的片段。在一些实施方案中，所述一种或多种在功能上无活性的片段能够减少补体激活。在一些实施方案中，因子b的切割导致功能降低的因子b片段的产生。
8、在一些实施方案中，因子b是啮齿动物因子b。在一些实施方案中，因子b是非人灵长类动物因子b。在一些实施方案中，非人灵长类动物是食蟹猴。在一些实施方案中，因子b是人因子b。在一些实施方案中，因子b包含如seq id no:1所示的氨基酸序列。
9、在一些实施方案中，因子b的切割发生在不被因子d靶向的位点处。在一些实施方案中，该位点处的切割产生至少两个不是ba和bb的片段。在一些实施方案中，与通过因子d进行的切割相比，该位点处的切割导致因子b切割产物ba和bb的产生减少。
10、在一些实施方案中，因子b的切割发生在因子d靶向的位点处。在一些实施方案中，因子d靶向的位点包括qqkr/kiv(seq id no:9)。在一些实施方案中，因子b切割位点包括选自以下的序列：wehr/kgt(seq id no:10)、knqkr/qkq(seq id no:11)、dvfy/qmi(seq idno:12)、egvd/ae(seq id no:13)、dhkl/ksg(seq id no:14)、tpw/sla(seq id no:15)、kvsead(seq id no:20)、irpskg(seq id no:4)、ggekrd(seq id no:5)、gkkeag(seq idno:3)和dhkl/ksg(seq id no:21)。
11、在一些实施方案中，工程化蛋白酶基于mtsp-1或upa(包括mtsp-1或upa蛋白酶结构域)，并且因子b中的切割位点包括选自wehr/kgt(seq id no:10)和knqkr/qkq(seq idno:11)的序列。
12、在一些实施方案中，工程化蛋白酶基于本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种工程化蛋白酶，所述工程化蛋白酶包含经修饰的糜酶蛋白酶结构域、经修饰的膜型丝氨酸蛋白酶1(MTSP-1)蛋白酶结构域、经修饰的尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)蛋白酶结构域或经修饰的激肽释放酶相关肽酶5(KLK5)蛋白酶结构域，其中所述工程化蛋白酶能够切割因子B。
2.根据权利要求1所述的工程化蛋白酶，其中所述工程化蛋白酶对因子B的切割产生一个或多个在功能上无活性的片段。
3.根据权利要求2所述的工程化蛋白酶，其中所述一个或多个在功能上无活性的片段能够减少补体激活。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的工程化蛋白酶，其中因子B的切割导致功能降低的因子B片段的产生。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化蛋白酶，其中所述因子B是非人灵长类动物因子B。
6.根据权利要求5所述的工程化蛋白酶，其中所述非人灵长类动物是食蟹猴。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化蛋白酶，其中所述因子B是人因子B。
8.根据权利要求7所述的工程化蛋白酶，其中所述因子B包含如SEQID NO:1所示的氨基酸序列
9.根据权利要求1至8中任一项所述的工程化蛋白酶，其中因子B的切割发生在不被因子D靶向的位点处。
10.根据权利要求9所述的工程化蛋白酶，其中在不被因子D靶向的所述位点处的切割产生至少两个不是Ba和Bb的片段。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的工程化蛋白酶，其中与通过因子D进行的切割相比，因子B的切割导致因子B切割产物Ba和Bb的产生减少。
12.根据权利要求1至8中任一项所述的工程化蛋白酶，其中因子B的切割发生在被因子D靶向的位点处。
13.根据权利要求12所述的工程化蛋白酶，其中因子D所靶向的因子B切割位点包含QQKR/KIV(SEQ ID NO:9)。
14.根据权利要求9所述的工程化蛋白酶，其中因子B切割位点包含选自以下的序列：WEHR/KGT(SEQ ID NO:10)、KNQKR/QKQ(SEQ ID NO:11)、DVFY/QMI(SEQ ID NO:12)、EGVD/AE(SEQ ID NO:13)、DHKL/KSG(SEQ ID NO:14)、TPW/SLA(SEQ ID NO:15)、KVSEAD(SEQ ID NO:20)、IRPSKG(SEQID NO:4)、GGEKRD(SEQ ID NO:5)、GKKEAG(SEQ ID NO:3)和DHKL/KSG(SEQID NO:21)。
15.根据权利要求9所述的工程化蛋白酶，其中因子B切割位点包含选自WEHR/KGT(SEQID NO:10)和KNQKR/QKQ(SEQ ID NO:11)的序列，并且其中所述工程化蛋白酶包含经修饰的MTSP-1蛋白酶结构域或经修饰的uPA蛋白酶结构域。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的工程化蛋白酶，其中所述工程化蛋白酶包含经修饰的MTSP-1蛋白酶结构域。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的工程化蛋白酶，其中所述工程化蛋白酶不包含经修饰的MTSP-1蛋白酶结构域。
18.根据权利要求16所述的工程化蛋白酶，所述工程化蛋白酶相对于包含如SEQ IDNO:7中所示的氨基酸序列的MTSP-1蛋白酶结构域包含一个或多个修饰。
19.根据权利要求18所述的工程化蛋白酶，其中所述修饰是一个或多个氨基酸残基的取代、添加和缺失中的一种或多种。
20.根据权利要求16所述的工程化蛋白酶，其中所述一个或多个修饰位于与包含SEQID NO:18所示的氨基酸序列的MTSP-1蛋白酶结构域中的选自D622、I640、L678、A686、F703、D705、F706、T707、F708、K719、C731、D734、Y755、Q783、V791、Q802、A814、D828和K835的一个或多个位置相对应的一个或多个位置处。
21.根据权利要求16所述的工程化蛋白酶，其中所述一个或多个修饰选自表5A中所示的那些。
22.根据权利要求16所述的工程化蛋白酶，其中所述一个或多个修饰选自表5B中所示的那些示例性突变串。
23.根据权利要求1至15中任一项所述的工程化蛋白酶，其中所述工程化蛋白酶包含经修饰的uPA蛋白酶结构域。
24.根据权利要求1至15中任一项所述的工程化蛋白酶，其中所述工程化蛋白酶不包含经修饰的uPA蛋白酶结构域。
25.根据权利要求23所述的工程化蛋白酶，所述工程化蛋白酶相对于包含如SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列的uPA蛋白...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种工程化蛋白酶，所述工程化蛋白酶包含经修饰的糜酶蛋白酶结构域、经修饰的膜型丝氨酸蛋白酶1(mtsp-1)蛋白酶结构域、经修饰的尿激酶型纤溶酶原激活物(upa)蛋白酶结构域或经修饰的激肽释放酶相关肽酶5(klk5)蛋白酶结构域，其中所述工程化蛋白酶能够切割因子b。
2.根据权利要求1所述的工程化蛋白酶，其中所述工程化蛋白酶对因子b的切割产生一个或多个在功能上无活性的片段。
3.根据权利要求2所述的工程化蛋白酶，其中所述一个或多个在功能上无活性的片段能够减少补体激活。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的工程化蛋白酶，其中因子b的切割导致功能降低的因子b片段的产生。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化蛋白酶，其中所述因子b是非人灵长类动物因子b。
6.根据权利要求5所述的工程化蛋白酶，其中所述非人灵长类动物是食蟹猴。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化蛋白酶，其中所述因子b是人因子b。
8.根据权利要求7所述的工程化蛋白酶，其中所述因子b包含如seqid no:1所示的氨基酸序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的工程化蛋白酶，其中因子b的切割发生在不被因子d靶向的位点处。
10.根据权利要求9所述的工程化蛋白酶，其中在不被因子d靶向的所述位点处的切割产生至少两个不是ba和bb的片段。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的工程化蛋白酶，其中与通过因子d进行的切割相比，因子b的切割导致因子b切割产物ba和bb的产生减少。
12.根据权利要求1至8中任一项所述的工程化蛋白酶，其中因子b的切割发生在被因子d靶向的位点处。
13.根据权利要求12所述的工程化蛋白酶，其中因子d所靶向的因子b切割位点包含qqkr/kiv(seq id no:9)。
14.根据权利要求9所述的工程化蛋白酶，其中因子b切割位点包含选自以下的序列：wehr/kgt(seq id no:10)、knqkr/qkq(seq id no:11)、dvfy/qmi(seq id no:12)、egvd/ae(seq id no:13)、dhkl/ksg(seq id no:14)、tpw/sla(seq id no:15)、kvsead(seq id no:20)、irpskg(seqid no:4)、ggekrd(seq id no:5)、gkkeag(seq id no:3)和dhkl/ksg(seqid no:21)。
15.根据权利要求9所述的工程化蛋白酶，其中因子b切割位点包含选自wehr/kgt(seqid no:10)和knqkr/qkq(seq id no:11)的序列，并且其中所述工程化蛋白酶包含经修饰的mtsp-1蛋白酶结构域或经修饰的upa蛋白酶结构域。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的工程化蛋白酶，其中所述工程化蛋白酶包含经修饰的mtsp-1蛋白酶结构域。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的工程化蛋白酶，其中所述工程化蛋白酶不包含经修饰的mtsp-1蛋白酶结构域。
18.根据权利要求16所述的工程化蛋白酶，所述工程化蛋白酶相对于包含如seq idno:7中所示的氨基酸序列的mtsp-1蛋白酶结构域包含一个或多个修饰。
19.根据权利要求18所述的工程化蛋白酶，其中所述修饰是一个或多个氨基酸残基的取代、添加和缺失中的一种或多种。
20.根据权利要求16所述的工程化蛋白酶，其中所述一个或多个修饰位于与包含seqid no:18所示的氨基酸序列的mtsp-1蛋白酶结构域中的选自d622、i640、l678、a686、f703、d705、f706、t707、f708、k719、c731、d734、y755、q783、v791、q802、a814、d828和k835的一个或多个位置相对应的一个或多个位置处。
21.根据权利要求16所述的工程化蛋白酶，其中所述一个或多个修饰选自表5a中所示的那些。
22.根据权利要求16所述的工程化蛋白酶，其中所述一个或多个修饰选自表5b中所示的那些示例性突变串。
23.根据权利要求1至15中任一项所述的工程化蛋白酶，其中所述工程化蛋白酶包含经修饰的upa蛋白酶结构域。
24.根据权利要求1至15中任一项所述的工程化蛋白酶，其中所述工程化蛋白酶不包含经修饰的upa蛋白酶结构域。
25.根据权利要求23所述的工程化蛋白酶，所述工程化蛋白酶相对于包含如seq idno:8所示的氨基酸序列的upa蛋白酶结构域包含一个或多个修饰。
26.根据权利要求25所述的工程化蛋白酶，其中所述修饰是一个或多个氨基酸残基的取代、添加和缺失中的一种或多种。
27.根据权利要求23所述的工程化蛋白酶，其中所述一个或多个修饰位于与包含seqid no:8所示的氨基酸序列的upa蛋白酶结构域中的选自s37、d60、l97、g161、r179、h180、v185、y187、i207、a247、d248、a251、h252、c279、y308、v316、a343、q353、r378、k385的一个或多个位置相对应的一个或多个位置处。
28.根据权利要求23所述的工程化蛋白酶，其中所述一个或多个修饰选自表3a中所示的那些。
29.根据权利要求23所述的工程化蛋白酶，其中所述一个或多个修饰选自表3b中所示的那些示例性突变串。
30.根据权利要求1至19中任一项所述的工程化蛋白酶，其中所述工程化蛋白酶包含经修饰的糜酶蛋白酶结构域。
31.根据权利要求1至19中任一项所述的工程化蛋白酶，其中所述工程化蛋白酶不包含经修饰的糜酶蛋白酶结构域。
32.根据权利要求30所述的工程化蛋白酶，其中所述工程化蛋白酶包含经修饰的糜酶蛋白酶结构域，并且所述切割位点包含选自dvfy/qmi(seq id no:12)、egvd/ae(seq idno:13)、dhkl/ksg(seq id no:14)和tpw/sla(seq id no:15)的序列。
33.根据权利要求30所述的工程化蛋白酶，所述工程化蛋白酶相对于包含如seq idno:6所示的氨基酸序列的糜酶蛋白酶结构域包含一个或多个修饰。
34.根据权利要求33所述的工程化蛋白酶，其中所述修饰是一个或多个氨基酸残基的取代、添加和缺失中的一种或多种。
35.根据权利要求30所述的工程化蛋白酶，其中所述一个或多个修饰位于与包含seqid no:6所示的氨基酸序列的糜酶蛋白酶结构域中的选自s36、c7、v21、p26、g31、r37、k74、k80、i90、l101、l103、f110、v125、f157、d159、s176、a177、f178、k179、l186、v196、g199、a203、a207、f209的一个或多个位置相对应的一个或多个位置处。
36.根据权利要求30所述的工程化蛋白酶，其中所述一个或多个修饰选自表7a中所示的那些。
37.根据权利要求30所述的工程化蛋白酶，其中所述一个或多个修饰选自表7b中所示的那些示例性突变串。
38.根据权利要求1至19中任一项所述的工程化蛋白酶，其中所述工程化蛋白酶包含经修饰的klk5蛋白酶结构域，其任选地包含seq id no:23的一个或多个氨基酸修饰。
39.根据权利要求1至19中任一项所述的工程化蛋白酶，其中所述工程化蛋白酶不包含经修饰的klk5蛋白酶结构域。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的工程化蛋白酶，其中所述工程化蛋白酶对于因子b切割具有约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1,000、约1,000、约1,100、约1,200、约1,300、约1,400、约1,500、约1,600、约1.700、约1,800或约1,900m-1s-1的kcat/km。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·波普科夫，V·索罗斯，N·勒莫安，G·E·布劳斯，T·迈尔斯，
申请(专利权)人：弗特克斯药品有限公司，
类型：发明
国别省市：
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