【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及褪黑素检测，具体涉及一种检测酿酒葡萄中褪黑素含量的方法。
技术介绍
1、褪黑素，又称为美拉酮宁、抑黑素、松果腺素，分子式为n-乙酰基-5-甲氧基色胺，褪黑素是具有多种生物活性的色氨酸衍生物，其合成途径因物种的不同而存在明显的差异。在哺乳动物、鸟类和两栖类等脊椎动物中，褪黑素的生物合成途径是比较清楚的。在植物中，虽然在1969年就于绣球百合的胚乳细胞中检测出褪黑素，但一直不清楚其合成途径，直到2000年利用c14标记的色氨酸体外供给离体贯叶连翅幼苗，发现动物褪黑素合成过程的中间产物在该幼苗中均检测出了放射性，证明褪黑素可以在植物体内合成运输，并且其合成与动物体内褪黑素的合成机制类似。由色氨酸生成褪黑素需要经过4个连续的酶促反应。这四个酶分别为色氨酸脱羧酶(tdc)、色胺-5-羟化酶(t5h)、5-羟色胺n-乙酰基转移酶(snat)、n-乙酰基-5-羟色胺-甲基转移酶(asmt)。
2、褪黑素作为一个广谱有效的抗氧化物质，能够显著提高植物在生物和非生物逆境胁迫下的耐受能力，通过研究表明，褪黑素可显著缓解酿酒葡萄铜胁迫，所以对酿酒葡萄中褪黑素的检测方法建立具有重要意义，此外，检测方法也会影响植物中褪黑素含量的准确测定，不同检测方法检测同一种材料时可能会得出不同的结果，目前，测定褪黑素的方法主要有电化学分析法、免疫分析法、色谱法等，专门针对植物中褪黑素检测的参考方法较少，专利申请号为cn108828098b的专利公开了一种高效液相色谱-质谱法测定棉花中褪黑素的方法，该专利在提取褪黑素时采用了c18固相萃取柱对褪
技术实现思路
1、针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种可以在褪黑素提取过程中减少褪黑素流失，提高褪黑素检测的含量，提高检测精度的可以对酿酒葡萄中褪黑素及5-羟基色氨酸含量的进行准确检测的方法。
2、一种检测酿酒葡萄中褪黑素含量的方法，具体包括以下步骤：
3、s1：标准工作液配制
4、取褪黑素标准品与5-羟基色氨酸标准品内加入甲醇制备褪黑素标准母液和5-羟基色氨酸标准母液；
5、s2：优化超高效液相色谱-串联质谱法(uplc-ms/ms)、
6、优化超高效液相色谱-串联质谱的色谱条件及质谱条件；
7、s3：测试仪器精密度
8、取褪黑素标准母液和5-羟基色氨酸标准母液，分别用甲醇稀释，将稀释后的褪黑素溶液与5-羟基色氨酸溶液根据优化后的检测方法连续进样，检测仪器精密度；
9、s4：绘制标准曲线
10、分别取褪黑素标准母液和5-羟基色氨酸标准母液稀释不同浓度的标准试液，在优化后的色谱条件下，每个浓度分别平行测定2-3次，以褪黑素标准溶液浓度为横坐标(x)，平均峰面积为纵坐标(y)，绘制褪黑素标准曲线，以5-羟基色氨酸标准溶液浓度为横坐标(x)，平均峰面积为纵坐标(y)，绘制5-羟基色氨酸标准曲线。
11、s5：酿酒葡萄前处理
12、夜间采摘新鲜的酿酒葡萄，并以不透光纸包裹带回后，在避光条件下清洗干净去籽后立刻用液氮进行速冻，避光条件下，取速冻后的酿酒葡萄放置于研钵内，加入甲醇和丙酮溶液，一起研磨粉碎，得到中间体ⅰ；
13、s6：褪黑素及5-羟基色氨酸的提取
14、避光条件下，将中间体ⅰ转移到带帽离心管中，加入玻璃珠后，涡旋混合，取出玻璃珠，将离心管在超声辅助提取，得到中间体ⅱ，将中间体ⅱ高速冷冻离心，得到上清液ⅰ与沉淀物，将上清液ⅰ放置于避光处备用，将沉淀物放置于带帽离心管中，并加入甲醇溶液再次提取，加入玻璃珠后涡旋混合，取出玻璃珠，超声辅助提取，将混合液再次高速冷冻离心得到上清液ⅱ，将上清液ⅰ与上清液ⅱ混合后通过有机相滤膜过滤，将过滤后的混合液通过氮气吹干，再用乙醇水溶液重新溶解，再次过有机相滤膜后，得到待测样，等待进行uplc-ms/ms检测；
15、s7：褪黑素及5-羟基色氨酸的含量检测
16、将待测样根据优化后的色谱条件与质谱条件检测，得到褪黑素及5-羟基色氨酸色谱图，根据峰面积并通过对应的标准曲线可计算得到褪黑素及5-羟基色氨酸的含量。
17、进一步地，步骤s1标准工作液配制，具体包括以下步骤：
18、s1.1：取褪黑素标准品0.1-0.2重量份，向褪黑素标准品内加入100-110重量份的甲醇，使其褪黑素标准品完全溶解后，得到褪黑素标准母液；
19、s1.2：取5-羟基色氨酸标准品0.1-0.2重量份，向5-羟基色氨酸标准品内加入100-110重量份的甲醇，使其5-羟基色氨酸标准品完全溶解后，得到5-羟基色氨酸标准母液。
20、进一步地，步骤s2优化超高效液相色谱-串联质谱法(uplc-ms/ms)，具体包括以下步骤：
21、s2.1：色谱条件：c18色谱柱梯度洗脱，流动相为0.1-0.15％甲酸-水溶液(a)，甲醇(b)，柱温为40-45℃，流速为0.3-0.4ml/min，进样量为5-10μl；
22、s2.2：质谱条件：esi离子源正/负双离子模式检测，正离子喷雾电压3500-3800v，负离子喷雾电压2500-2800v，鞘气35-40arb，辅气10-15arb，离子传输管温度325-350℃，雾化温度350-375℃，确定碎片离子峰，分析时间20-25min。
23、进一步地，步骤s3测试仪器精密度，具体包括以下步骤：
24、s3.1：取1-2重量份的褪黑素标准母液和5-羟基色氨酸标准母液，分别用甲醇稀释至0.1-0.15mg/l；
25、s3.2：将稀释后的褪黑素溶液与5-羟基色氨酸溶液根据优化后的检测方法连续进样6-7针，检测仪器精密度。
26、进一步地，步骤s4绘制标准曲线，具体包括以下步骤：
27、s4.1：分别取6-7份1-2重量份的褪黑素标准母液和5-羟基色氨酸标准母液稀释至7种不同浓度的标准试液；
28、s4.2：在优化后的色谱条件下，每个浓度分别平行测定3次；
29、s4.3：以褪黑素标准溶液浓度为横坐标(x)，平均峰面积为纵坐标(y)，绘制褪黑素标准曲线，以5-羟基色氨酸标准溶液浓度为横坐标(x)，平均峰面积为纵坐标(y)，绘制5-羟基色氨酸标准曲线。
30、进一步地，步骤s5酿酒葡萄前处理，具体包括以下步骤：
31、s5.1：夜间采摘新鲜的酿酒葡萄，并以不透光纸包裹带回后，在避光条件下清洗干净去籽后立刻用液氮进行速冻后放入-80℃～-85℃下保存，备用；
32、s5.2：避光条件下，取2-4重量份速冻的酿酒葡萄放置于研钵内本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测酿酒葡萄中褪黑素含量的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种检测酿酒葡萄中褪黑素含量的方法，其特征在于，步骤S1标准工作液配制，具体包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的一种检测酿酒葡萄中褪黑素含量的方法，其特征在于，步骤S2优化超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)，具体包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的一种检测酿酒葡萄中褪黑素含量的方法，其特征在于，步骤S3测试仪器精密度，具体包括以下步骤：
5.根据权利要求1所述的一种检测酿酒葡萄中褪黑素含量的方法，其特征在于，步骤S4绘制标准曲线，具体包括以下步骤：
6.根据权利要求1所述的一种检测酿酒葡萄中褪黑素含量的方法，其特征在于，步骤S5酿酒葡萄前处理，具体包括以下步骤：
7.根据权利要求5所述的一种检测酿酒葡萄中褪黑素含量的方法，其特征在于，步骤S6褪黑素及5-羟基色氨酸的提取，具体包括以下步骤：
8.根据权利要求1所述的一种检测酿酒葡萄中褪黑素含量的方法，其特征在于，步骤S7褪黑素及5
9.根据权利要求5所述的一种检测酿酒葡萄中褪黑素含量的方法，其特征在于，
10.根据权利要求7所述的一种检测酿酒葡萄中褪黑素含量的方法，其特征在于，玻璃珠为1.5-2.0mm的玻璃珠。
...【技术特征摘要】
1.一种检测酿酒葡萄中褪黑素含量的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种检测酿酒葡萄中褪黑素含量的方法，其特征在于，步骤s1标准工作液配制，具体包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的一种检测酿酒葡萄中褪黑素含量的方法，其特征在于，步骤s2优化超高效液相色谱-串联质谱法(uplc-ms/ms)，具体包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的一种检测酿酒葡萄中褪黑素含量的方法，其特征在于，步骤s3测试仪器精密度，具体包括以下步骤：
5.根据权利要求1所述的一种检测酿酒葡萄中褪黑素含量的方法，其特征在于，步骤s4绘制标准曲线，具体包括以下步骤：
【专利技术属性】
技术研发人员：赵丹青，孙翔宇，葛谦，陈翔，闫玥，张静，李彩虹，开建荣，纪丽香，杨斌坤，陈望，
申请(专利权)人：宁夏农产品质量标准与检测技术研究所宁夏农产品质量监测中心，
类型：发明
国别省市：
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