【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于双光子荧光材料及生物荧光成像领域，涉及一种4-亚基丙二腈-苯并吡喃衍生物荧光染料在生物荧光成像中的应用。
技术介绍
1、荧光成像作为一种非侵入性的成像技术，具有快速便捷、实时无损、高灵敏度以及低成本的优势，在生物医学领域应用广泛。其中较为重要的就是成像剂的开发与应用。其中小分子荧光发色团作为成像剂不仅易于使用，还具有成本低和灵敏度高等优势，并能够在亚细胞这种微小尺寸水平上可视化生命系统。因此，已经有许多研究者们为此目的探索了许多高性能发色团，例如香豆素、荧光素、吲哚、bodipy、罗丹明等经典发色团。然而这些染料分子通常在传统的单光子共聚焦显微镜(1pm)中存在光散射严重、单光子激发的能耗大等问题，从而致使其穿透性差，限制了其生命科学领域中的应用。因此，在过去的二十年中，基于光和物质之间非线性光学相互作用的双光子共聚焦显微镜(2pm)已经成为生物物种成像的重要工具。相较于激发单光子吸收的激光器，激发双光子吸收的激光器的辐射光源波长一般位于可见-近红外区。双光子激发波长较长，对生物分子的光毒性小，能够穿透更深的标本；且仅在焦平面上才有吸收，成像空间分辨率高。双光子荧光成像在生物领域已经有了广泛的应用，特别是，2pm的这些优越的特征也促使化学家寻找合成简单及具有大吸收截面的双光子吸收(tpa)发色团，并用于生物过程的检测和成像。然而，目前双光子荧光成像染料仍存在着种类少、合成复杂等问题。
2、本专利技术发现一种具有强双光子吸收的4-亚基丙二腈-苯并吡喃衍生物荧光染料，其具有较好的生物相容性、细胞膜渗透性及靶
技术实现思路
1、专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种4-亚基丙二腈-苯并吡喃衍生物荧光染料在生物荧光成像中的应用。
2、技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：
3、本专利技术涉及的一种4-亚基丙二腈-苯并吡喃衍生物荧光染料的结构如下：
4、
5、本专利技术涉及的一种4-亚基丙二腈-苯并吡喃衍生物荧光染料(i)的合成路线为：
6、
7、本专利技术涉及的一种4-亚基丙二腈-苯并吡喃衍生物荧光染料的制备过程包括以下步骤：
8、将9-醛基久洛尼定和2-(2-甲基-4h-苯并吡喃-4-亚基)丙二腈溶于乙腈中，向溶液中滴加哌啶，在氮气保护下82℃加热回流反应3h，反应结束后冷却至室温，使用旋转蒸发仪除去有机溶剂，使用二氯甲烷-石油醚作为洗脱剂通过硅胶柱层析分离提纯得到的4-亚基丙二腈-苯并吡喃衍生物荧光染料(i)；
9、上述反应步骤中，9-醛基久洛尼定与2-(2-甲基-4h-苯并吡喃-4-亚基)丙二腈的物质的量比为1∶1.2；
10、上述反应步骤中，反应温度为82℃，反应时间为3小时；
11、上述分离提纯步骤中，洗脱剂二氯甲烷-石油醚体积比为4∶1。
12、本专利技术所述的一种4-亚基丙二腈-苯并吡喃衍生物荧光染料的应用，包括如下步骤：
13、单光子共聚焦荧光成像：
14、将hela细胞转移至35mm培养皿中，使用dmem培养基在37℃和5％co2的培养箱中孵育细胞两天。在37℃加入4-亚基丙二腈-苯并吡喃衍生物荧光染料(i)(1μm)孵育细胞60分钟，将培养基吸出，再用清洗液清除多余的混合物，清洗三次，以防影响后期检测，然后用单光子leica tcs sp8(莱卡，德国)激光共聚焦显微镜荧光成像(激发波长：488nm)，获取单光子荧光成像图。
15、双光子生物荧光成像：
16、按照用于共聚焦显微镜的相同方法培养两种细胞。使用hek细胞培养24小时后，在细胞培养皿中加入4-亚基丙二腈-苯并吡喃衍生物荧光染料(i)(1μm)。让它们在37℃下孵育30分钟，将培养基吸出，再用清洗液清除多余的混合物，清洗三次，以防影响后期检测，然后使用自制的双光子显微镜进行共聚焦显微镜荧光成像，获取双光子荧光成像图。采集荧光强度图像(使用63x水浸物镜以及使用单光子计数单元的flim图像。
17、本专利技术的有益效果：
18、与现有技术相比，本专利技术中4-亚基丙二腈-苯并吡喃衍生物荧光染料在生物荧光成像中的应用所具有的优点有：(1)4-亚基丙二腈-苯并吡喃衍生物荧光染料制备条件简单、反应条件温和、产率高；(2)4-亚基丙二腈-苯并吡喃衍生物在四氢呋喃溶剂中的最大荧光发射波长在680nm左右，且具有大的stokes位移(＞125nm)和大的双光子吸收截面；(3)4-亚基丙二腈-苯并吡喃衍生物具有良好的细胞渗透性和生物相容性，能应用于hela细胞的单光子共聚焦显微成像及hek细胞的双光子荧光成像，并能定位到线粒体，克服了传统生物成像中背景干扰严重、穿透性差的问题。
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1.一种4-亚基丙二腈-苯并吡喃衍生物荧光染料(I)在生物荧光成像中的应用，其特征在于，能应用于Hela细胞的单光子激发共聚焦成像和HEK细胞的双光子激发显微成像。
2.一种权利要求1所述的一种4-亚基丙二腈-苯并吡喃衍生物荧光染料(I)具有好的双光子吸收性能，在800-850nm区域，双光子吸收截面为200-250GM，而在970-1020nm区域，双光子吸收截面为270-300GM。
3.一种权利要求1所述的一种4-亚基丙二腈-苯并吡喃衍生物荧光染料(I)在Hela细胞共聚焦成像中的应用，其特征在于，所述荧光染料能聚集在线粒体细胞器内。
【技术特征摘要】
1.一种4-亚基丙二腈-苯并吡喃衍生物荧光染料(i)在生物荧光成像中的应用，其特征在于，能应用于hela细胞的单光子激发共聚焦成像和hek细胞的双光子激发显微成像。
2.一种权利要求1所述的一种4-亚基丙二腈-苯并吡喃衍生物荧光染料(i)具有好的双光子吸收性能，在800-8...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐海军，金颖，王乐，顾婷婷，史东海，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：
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