一种发酵液中γ－聚谷氨酸的提取方法技术

本发明专利技术公开了一种发酵液中γ－聚谷氨酸的提取方法，即菌种经活化、种子培养、发酵后所得的发酵液离心，取上清液调ｐＨ２～３，然后加入异丙醇静置沉淀后离心，所得的沉淀物进行真空冷冻干后，用蒸馏水溶解，透析去除小分子和有机溶剂，再将透析液用聚乙二醇浓缩，然后将浓缩液真空冷冻干即得到γ－聚谷氨酸纯品。本发明专利技术的提取方法由于采用异丙醇作为沉淀剂其沉淀效果好，而且用量相对较少，且异丙醇可回收反复利用，从而降低生产成本。另外异丙醇在离心得到沉淀时离心条件可以相对较低，从而工艺简化，并且从一定程度上减少能耗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及聚谷氨酸的生产领域，具体是一种利用有机溶剂沉淀法提取发酵 液中聚谷氨酸的方法。
技术介绍
y -聚谷氨酸(Y -PGA，Polyglutamic acid)是一种由D_或L_谷氨酸通过a -氨 基和羧基形成谷氨酰键结合而成的阴离子聚合物。Y-PGA是一种水溶性可生物降 解的环境友好型多功能生物材料，具有可食用性、无毒性、成膜性、粘结性、保湿性等特点， 既可以作为药物载体、增稠剂和保湿剂用于医药、食品和化妆品中，也可以作为保水剂及水 果、蔬菜的防冻剂、保鲜剂，也可以作为水处理的絮凝剂和重金属螯合剂等，同时还是一种 新型的绿色环保塑料。Y-PGA产品价格昂贵，用途非常广泛，需求空间巨大，而目前Y-PGA 产品的生产和供应远远满足不了市场需要。Y-PGA的合成方法主要有化学合成法、提取 法和微生物发酵法，前两种方法由于自身的各种缺点不能得到广泛应用，目前生产Y-PGA 的主要方法是微生物发酵法。Y "PGA是一种由菌体分泌到胞外的多肽，通过液体发酵可 以得到含有大量产物的发酵液，从发酵液中提取产物的方法通常有化学沉淀法、有机溶剂 沉淀法，膜分离沉淀法。膜分离沉淀法的成本较大，而且工艺相对比较复杂，存在一定局限 性；化学沉淀法通常是利用无机盐进行沉淀，在后续处理中脱盐的步骤比较复杂，同时由于 Y-PGA分子内含有大量的游离羧基，易于众多无机盐离子结合从而更一步增加了脱盐的复 杂性，所以该法也存在一定局限性；有机溶剂沉淀法是普遍应用的提取聚谷氨酸方法， 但是目前有机溶剂主要是乙醇，提取过程中乙醇的用量比较大，成本较高，且提取工艺比较 复杂，由于该法也存在一定的局限性，所以目前还没有相关文献报道已经实现了工业化。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种生产成本低廉、生产工艺简单、生产条件温和的 聚谷氨酸提取方法本专利技术的技术方案一种发酵液中Y “聚谷氨酸的提取方法，其提取步骤如下(1)、发酵液的制备(a)、挑取一环枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)接种于斜面培养基中，在恒温 培养箱中35 40°C培养12小时，作为活化菌种；其中所述的斜面培养基(LB培养基)成分如下蛋白胨l.Og，牛肉膏 0. 5g，NaCl 0. 5g，葡萄糖 0. lg，琼脂 2. 0g，酵母粉0. 2g,蒸馏水 100ml，pH 7. 4 7. 5 ；(b)、将(a)活化后的菌种挑取一环接种于种子培养基中，摇床转速为180 220r/ min,35 40°C振荡培养5 15小时作为种子液；其中所述的种子培养基成分如下蔗糖10 15g，牛肉膏 2.0 1.8g，谷氨酸钠 10 15g，MgS04*7H200. 10 0. 15g、 K2HP04 3H20 0. 4 0. 8g，水 300ml, pH 7. 0 7. 5 ；(c)、按4% 8%的接种量将(b)所得的种子液接种到液体发酵培养基中，摇床转 速为180 220r/min，35 40°C振荡培养20 48小时得到含有产物的发酵液；其中所述的液体发酵培养基成分如下蔗糖15 25g，牛肉膏 2 6g，谷氨酸钠 15 25g，MgS04 7H20 0. 10 0. 15g、 K2HP04 3H20 0. 5 1. 5g，水 500ml, pH 7. 0 7. 5 ;(2)、将步骤(1)中(c)所得的发酵液离心，转速为5000 12000r/min，离心时间 15 40min，取离心后的上清液，沉淀弃去；(3)、将步骤(2)所得的上清液调pH2 3，然后加入一定量的预冷至4°C的异丙 醇，得上清液和异丙醇的混合物；其中异丙醇的加入量为上清液体积的1 4倍；(4)将步骤(3)所得的上清液和异丙醇的混合物在-18 20°C下静置沉淀8 30h小时后，将静置得到的沉淀混合物在转速为3000 lOOOOr/min下离心5 lOmin，弃 去上清，得沉淀物；(5)、将步骤(4)所得的沉淀物在真空度为2. 5Pa下，进行真空冷冻干24h得到 聚谷氨酸粗品；(6)、将步骤(5)所得的聚谷氨酸粗品用适量蒸馏水溶解，将所得溶液放入透 析袋中，用蒸馏水反复透析去除小分子和有机溶剂；(7)、将透析液用聚乙二醇浓缩，然后将浓缩液在真空度为2. 5Pa下，进行真空冷 冻干48h即得聚谷氨酸纯品。本专利技术的有益效果本专利技术利用了经典且常用的提取生物材料的方法——有机溶剂沉淀法提取发酵 液中的聚谷氨酸。目前提取聚谷氨酸的有机溶剂主要是乙醇，可是提取过程中乙 醇的用量比较大，而异丙醇作为沉淀剂其沉淀效果更好，而且其用量也相对较少。同时异丙 醇作为一种重要的化工原料，主要用于制药、化妆品、塑料、香料、涂料及电子工业上用作脱 水剂及清洗剂，对其研究比较成熟，因为异丙醇和水可以形成共沸物，利用间歇恒沸精馏法 从异丙醇水溶液中回收异丙醇已经实现了工业化，这样可以很大程度上减少聚谷氨酸 的生产成本。另外异丙醇的亲水性不如乙醇强，在离心得到沉淀时离心条件可以相对较低， 从而工艺简化，并且从一定程度上减少能耗。本专利技术于现有技术相比，不仅降低了生产成本也简化了生产工艺。具体实施例方式实施例1菌种选择选择枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis GIM1. 286)接种于斜面培养基 中，在恒温培养箱中37°C培养12小时，作为活化菌种。将活化后的菌种挑取一环接种于种 子培养基中，摇床转速为220r/min，37°C振荡培养15小时作为种子液。按5%的接种量将 种子液接种到液体发酵培养基中，摇床转速为220r/min，37°C振荡培养24小时得到含有产 物的发酵液。4将发酵液离心，转速为5000r/min，离心时间30min。取离心后的上清液，沉淀弃 去。上清液调PH2 3，然后一边缓慢搅拌一边加入2倍预冷异丙醇，将上述混合物在_18°C 下静置数小时20h。将混合物离心，5000r/min，8min，弃去上清。沉淀进行真空冷冻干燥得到粗品。粗品用适量蒸馏水溶解，将所得溶液放入透析 袋中，用蒸馏水反复透析24小时，去除小分子和有机溶剂。将透析液用聚乙二醇浓缩，然后 将浓缩液进行真空冷冻干燥，得到纯品，产量为13. 80g/L。其中培养基组分分别是斜面培养基(LB培养基)蛋白胨l.Og，牛肉膏0. 5g，NaCl 0. 5g，葡萄糖0. lg，琼 脂 2. 0g，酵母粉 0. 2g，蒸馏水 100ml, pH 7. 5 ；种子培养基蔗糖12g，牛肉膏2. 4g，谷氨酸钠12g，MgS04 7H20 0. 12g、 K2HP04 3H20 0. 6g，水 300ml, pH 7. 5 ；液体发酵培养基蔗糖20g，牛肉膏4g，谷氨酸钠20g，MgS04 7H20 0. 125g、 K2HP04 3H20 1. 0g，水 500ml, pH 7. 5。实施例2菌种选择选择枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis GIM1. 286)接种于斜面培养基 中，在恒温培养箱中37°C培养12小时，作为活化菌种。将活化后的菌种挑取一环接种于种 子培养基中，摇床转速为220r/min，37°C振荡培养15小时作为种子液。按5%的接种量将 种子液接种到液体发酵培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种发酵液中ν－聚谷氨酸的提取方法，其特征在于其提取方法包括如下步骤：　　（１）、发酵液的制备　　（ａ）、挑取一环枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）接种于斜面培养基中，在恒温培养箱中３５～４０℃培养１２小时，作为活化菌种；其中所述的斜面培养基（ＬＢ培养基）成分如下：　　蛋白胨１．０ｇ，牛肉膏０．５ｇ，ＮａＣｌ　０．５ｇ，葡萄糖０．１ｇ，琼脂２．０ｇ，　　酵母粉０．２ｇ，蒸馏水１００ｍｌ，ｐＨ７．４～７．５；　　（ｂ）、将（ａ）活化后的菌种挑取一环接种于种子培养基中，摇床转速为１８０～２２０ｒ／ｍｉｎ，３５～４０℃振荡培养５～１５小时作为种子液；　　其中所述的种子培养基成分如下：　　蔗糖１０～１５ｇ，牛肉膏２．０～１．８ｇ，谷氨酸钠１０～１５ｇ，ＭｇＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ０．１０～０．１５ｇ、Ｋ↓［２］ＨＰＯ↓［４］.３Ｈ↓［２］Ｏ　０．４～０．８ｇ，水３００ｍｌ，ｐＨ７．０～７．５；　　（ｃ）、按４％～８％的接种量将（ｂ）所得的种子液接种到液体发酵培养基中，摇床转速为１８０～２２０ｒ／ｍｉｎ，３５～４０℃振荡培养２０～４８小时得到含有产物的发酵液；　　其中所述的液体发酵培养基成分如下：　　蔗糖１５～２５ｇ，牛肉膏２～６ｇ，谷氨酸钠１５～２５ｇ，ＭｇＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ　０．１０～０．１５ｇ、Ｋ↓［２］ＨＰＯ↓［４］.３Ｈ↓［２］Ｏ　０．５～１．５ｇ，水５００ｍｌ，ｐＨ７．０～７．５；　　（２）、将步骤（１）中（ｃ）所得的发酵液离心，控制转速为５０００～１２０００ｒ／ｍｉｎ，离心时间１５～４０ｍｉｎ，取离心后的上清液，沉淀弃去；　　（３）、将步骤（２）所得的上清液调ｐＨ２～３，然后加入一定量的预冷至４℃的异丙醇，得上清液和异丙醇的混合物；　　其中异丙醇的加入量为上清液体积的１～４倍；　　（４）、将步骤（３）所得的上清液和异丙醇的混合物在－１８～２０℃下静置沉淀８～３０ｈ小时后，将静置得到的沉淀混合物在转速为３０００～１００００ｒ／ｍｉｎ下离心５～１０ｍｉｎ，弃去上清，得沉淀物；　　（５）、将步骤（４）所得的沉淀物在真空度为２．５Ｐａ下，进行真空冷冻干２４ｈ得到γ－聚谷氨酸粗品；　　（６）、将步骤（５）所得的γ－聚谷氨酸粗品用适量蒸馏水溶解，将所得溶液放入透析袋中，用蒸馏水反复透析去除小分子和有机溶剂；　　（７）、将透析液用聚乙二醇浓缩，然后将浓缩液在真空度为２．５Ｐａ下，进行真空冷冻干４...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马霞，鞠蕾，
申请(专利权)人：上海应用技术学院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]