【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分析化学，涉及采用液相色谱法检测抗体偶联药物中残留小分子的方法，具体为检测抗体偶联药物中残留sn38小分子含量的液相色谱法。
技术介绍
1、抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，adc)是将单克隆抗体药物的高特异性和小分子细胞毒药物的高活性相结合，用以提高肿瘤药物的靶向性、减少毒副作用。小分子细胞毒药物通过连接子(linker)结构与蛋白结构进行偶联，制备得到adc。cl2a是一种常用的连接子，拓扑异构酶i抑制剂sn38是一种常用的小分子细胞毒药物，将cl2a与sn38首先连接得到药物连接子cl2a-sn38(drug-linker conjugate)。在adc制备过程中，抗体首先通过还原剂打开二硫键，进一步与过量的cl2a-sn38反应；通过纯化手段，过量的cl2a-sn38会被除去，但仍然可能残留少量的游离cl2a-sn38，造成潜在的毒副反应。因此，残留cl2a-sn38的含量检测是adc药物的关键质量参数。
2、现有技术中，常采用高效液相色谱法对adc药物残留小分子含量进行检测。adc样品加入过量沉淀剂后沉淀离心，得到溶解有小分子细胞毒药物的上清液，通过反向色谱柱进行定量分析。缺点是：1.沉淀离心等前处理步骤耗时长；2.沉淀剂通常由有机溶剂和盐溶液按照不同配比组成，沉淀剂的筛选步骤耗时长且容易发生沉淀不完全现象。针对cl2a-sn38，在前期试验中我们发现沉淀前处理步骤中会发生明显的小分子水解，导致液相谱图复杂。
3、另外一种适用cl2a-sn38的实验室检
技术实现思路
1、解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，获得一种无需前置沉淀处理、针对含游离sn38的adc样品可直接进样检测的方法，同时保证具有良好的灵敏度、专属性和线性；鉴于此，本专利技术提供了检测抗体偶联药物中残留sn38小分子含量的液相色谱法。
2、技术方案：检测抗体偶联药物中残留sn38小分子含量的液相色谱法，所述方法为将抗体偶联药物adc样品直接进样或稀释后进样，采用反相色谱法检测样品中游离拓扑异构酶i抑制剂sn38的含量；所述adc样品为偶联有sn38的抗体偶联药物；所述反相色谱法的流动相a为0.1％三氟乙酸水溶液，流动相b为0.1％三氟乙酸乙腈溶液；所述反相色谱法的洗脱梯度为下表：
3、 时间/分钟 流动相a比例/％ 流动相b比例/％ 0 90 10 19 62.5 37.5 19.1 0 100 23 0 100 23.1 90 10 25 90 10
4、。
5、优选的，所述sn38小分子为基于sn38的药物连接子，包括cl2a-sn38，cl2e-sn38，mc-vc-pab-sn38。相应地，所述抗体偶联药物adc不限于各类抗体，也不限于连接子的种类。
6、优选的，adc样品稀释的稀释剂采用水、甲醇、乙腈、乙醇、异丙醇中的至少一种。
7、优选的，所述稀释剂为乙腈与水体积比为25:75的混合溶液。
8、优选的，adc样品的缓冲液并无特殊限定，可以为本领域技术人员熟知的各类缓冲液，优选为组氨酸、精氨酸、蔗糖、海藻糖、聚山梨酯中的至少一种。
9、优选的，所述反相色谱法的色谱柱为适合蛋白分离的大孔径反相液相色谱柱，如：苯基键合相的安捷伦advancebio rp-mab色谱柱；其紫外检测的波长为370nm，流速为0.5ml/min，进样量为40μl，柱温25℃。
10、优选的，所述方法包括绘制sn38小分子标准品的线性标准曲线，包括以下步骤：
11、(1)将sn38小分子标准品用二甲基乙酰胺dma溶解，制成浓度为10mm的母液；
12、(2)将步骤(1)制得的母液采用稀释剂配制成线性标准溶液，浓度为：
13、
14、
15、；其中，稀释剂为水、甲醇、乙腈、乙醇、异丙醇中的至少一种。
16、优选的，采用乙腈:水的体积比为50:50的混合溶液稀释时，以标准溶液的浓度为横坐标、色谱峰面积为纵坐标绘制的标准曲线的线性方程为：y＝72.677x-4.5826，r2＝0.9991；采用乙腈:水的体积比为25:75的混合溶液稀释时，绘制的标准曲线的线性方程为：y＝88.2245x-4.5635，r2＝0.9991。
17、优选的，所述方法的具体步骤包括：
18、s1、绘制标准曲线
19、精密称定sn38小分子标准品，采用二甲基乙酰胺dma溶解制成母液；然后采用稀释剂逐级稀释制成线性标准溶液，进样、洗脱，以标准溶液的浓度为横坐标、色谱峰面积为纵坐标制作线性标准曲线，得到线性方程；
20、s2、检测抗体偶联药物adc样品中的sn38含量
21、将抗体偶联药物adc样品直接进样或稀释后进样、洗脱，读取色谱峰面积，根据s1中得到的线性方程计算样品中sn38浓度，及加标回收率，其中加标回收率/％＝实测加标量/理论加标量×100％。
22、优选的，所述方法的加标回收率为80-120％。
23、有益效果：(1)本专利技术所述方法针对含残留sn38小分子的adc样品，且样品可以稀释或不稀释直接进样，无需沉淀、离心等复杂的前置处理，从而大大缩短了检测时间；(2)所述方法避免了因前置处理导致的沉淀不完全和小分子水解现象，因此具有很高的灵敏度；(3)所述方法具有良好的专属性、重复性本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.检测抗体偶联药物中残留SN38小分子含量的液相色谱法，其特征在于，所述方法为将抗体偶联药物ADC样品直接进样或稀释后进样，采用反相色谱法检测样品中游离拓扑异构酶I抑制剂SN38的含量；所述ADC样品为偶联有SN38的抗体偶联药物；所述反相色谱法的流动相A为0.1％三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸乙腈溶液；所述反相色谱法的洗脱梯度为下表：
2.根据权利要求1所述的检测抗体偶联药物中残留SN38小分子含量的液相色谱法，其特征在于，所述SN38小分子为基于SN38的药物连接子，包括CL2A-SN38，CL2E-SN38，
3.根据权利要求1所述的检测抗体偶联药物中残留SN38小分子含量的液相色谱法，其特征在于，ADC样品稀释的稀释剂采用水、甲醇、乙腈、乙醇、异丙醇中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的检测抗体偶联药物中残留SN38小分子含量的液相色谱法，其特征在于，所述稀释剂为乙腈与水体积比为25:75的混合溶液。
5.根据权利要求1所述的检测抗体偶联药物中残留SN38小分子含量的液相色谱法，其特征在于，ADC样品的缓冲液
6.根据权利要求1所述的检测抗体偶联药物中残留SN38小分子含量的液相色谱法，其特征在于，所述反相色谱法的色谱柱为适合蛋白分离的大孔径反相液相色谱柱，其紫外检测的波长为370nm，流速为0.5mL/min，进样量为40μL，柱温25℃。
7.根据权利要求1所述的检测抗体偶联药物中残留SN38小分子含量的液相色谱法，其特征在于，所述方法包括绘制SN38小分子标准品的线性标准曲线，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的检测抗体偶联药物中残留SN38小分子含量的液相色谱法，其特征在于，采用乙腈:水的体积比为50:50的混合溶液稀释时，以标准溶液的浓度为横坐标、色谱峰面积为纵坐标绘制的标准曲线的线性方程为：y＝72.677x-4.5826，R2＝0.9991；采用乙腈:水的体积比为25:75的混合溶液稀释时，绘制的标准曲线的线性方程为：y＝88.2245x-4.5635，R2＝0.9991。
9.根据权利要求1所述的检测抗体偶联药物中残留SN38小分子含量的液相色谱法，其特征在于，所述方法的具体步骤包括：
10.根据权利要求9所述的检测抗体偶联药物中残留SN38小分子含量的液相色谱法，其特征在于，所述方法的加标回收率为80-120％。
...【技术特征摘要】
1.检测抗体偶联药物中残留sn38小分子含量的液相色谱法，其特征在于，所述方法为将抗体偶联药物adc样品直接进样或稀释后进样，采用反相色谱法检测样品中游离拓扑异构酶i抑制剂sn38的含量；所述adc样品为偶联有sn38的抗体偶联药物；所述反相色谱法的流动相a为0.1％三氟乙酸水溶液，流动相b为0.1％三氟乙酸乙腈溶液；所述反相色谱法的洗脱梯度为下表：
2.根据权利要求1所述的检测抗体偶联药物中残留sn38小分子含量的液相色谱法，其特征在于，所述sn38小分子为基于sn38的药物连接子，包括cl2a-sn38，cl2e-sn38，
3.根据权利要求1所述的检测抗体偶联药物中残留sn38小分子含量的液相色谱法，其特征在于，adc样品稀释的稀释剂采用水、甲醇、乙腈、乙醇、异丙醇中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的检测抗体偶联药物中残留sn38小分子含量的液相色谱法，其特征在于，所述稀释剂为乙腈与水体积比为25:75的混合溶液。
5.根据权利要求1所述的检测抗体偶联药物中残留sn38小分子含量的液相色谱法，其特征在于，adc样品的缓冲液为组氨酸、精氨酸、蔗糖、海藻糖、聚山梨酯中的至少一种。
6.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：张硕，黄好，
申请(专利权)人：上海药明合联生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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