【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学，具体涉及一种单个细胞外囊泡表面聚糖的检测方法。
技术介绍
1、聚糖(glycan)是由多种不同单糖单元组装而成的具有明确结构的大分子聚合物，可修饰于蛋白质、脂质乃至rna进而对这些生物分子的结构和功能进行调控。几乎所有的细胞膜最外表面都覆盖着一层由聚糖组成的厚重糖萼，参与细胞粘附、信号转导、细胞间互作和病原体入侵等生物过程。
2、细胞外囊泡(extracellular vesicles，evs)是粒径在30～200nm、由磷脂双层膜包被的纳米小泡。亲本细胞通过内源分选将特定的货物装载入囊泡，使其成为细胞间物质交流和信息传递的信使。同细胞膜一样，细胞外囊泡的外膜也环绕着一层聚糖，参与包括受体识别、细胞摄取和癌症转移在内等生理和病理过程，对其进行准确分析对于evs生物学功能的了解和后续应用的开发尤其重要。
3、目前，基于凝集素的免疫印迹技术或者elisa技术被广泛用于evs聚糖的检测，通过凝集素这一类可识别特定聚糖结构的糖结合蛋白的识别可以确定evs中存在的特定聚糖。这些方法虽然通量高、操作便捷，但也存在特异性差、灵敏度低的缺点。一方面，由于聚糖的非模板化合成和复杂结构，其特异性识别相对于蛋白质和核酸更为困难；另一方面，evs的纳米尺寸大小限制了能携载聚糖的容量，同时其巨大的异质性又容易受复杂样本环境和检测技术的影响而丢失。因而，发展一种在单个ev水平对其表面聚糖进行检测的技术是极具挑战性的。
技术实现思路
1、本专利技术目的在于克服现
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一种单个细胞外囊泡表面聚糖的检测方法，包括如下步骤：
4、(1)用衍生化试剂对纯化后的细胞外囊泡表面的聚糖分子进行衍生化；
5、(2)用生物标签分子对步骤(1)中衍生化后的聚糖分子进行标记，获得标记的细胞外囊泡；该生物标签分子具有与衍生化后的聚糖分子结合的结合基团和信号能被高灵敏流式细胞仪检测的指示基团；
6、(3)用高灵敏流式细胞仪对上述标记的细胞外囊泡进行检测。
7、在本专利技术的一个优选实施方案中，所述衍生化试剂选自naio4、半乳糖氧化酶和糖基转移酶。
8、在本专利技术的一个优选实施方案中，所述结合基团包括羟胺基团、叠氮基团、亲和素基团、炔烃基团、反式环辛烯基团(tco)、四嗪基团、抗体基团和受体基团中至少一种。
9、进一步优选的，所述炔烃基团包括双环[6.1.0]双炔基团(bcn)和二苯并环辛炔基团(dbco)。
10、在本专利技术的一个优选实施方案中，所述指示基团包括荧光染料基团和功能蛋白基团。
11、在本专利技术的一个优选实施方案中，所述衍生化试剂选自naio4、半乳糖氧化酶和糖基转移酶；所述结合基团包括羟胺基团、叠氮基团、亲和素基团、炔烃基团、反式环辛烯基团(tco)、四嗪基团、抗体基团和受体基团中至少一种；所述指示基团包括荧光染料基团和功能蛋白基团。
12、进一步优选的，所述炔烃基团包括双环[6.1.0]双炔基团(bcn)和二苯并环辛炔基团(dbco)。
13、在本专利技术的一个优选实施方案中，所述聚糖分子为唾液酸聚糖。
14、进一步优选的，所述衍生化试剂为naio4。
15、更进一步优选的，所述生物标签分子为xfd hydroxylamine荧光染料。
16、本专利技术的有益效果是：
17、1、本专利技术以聚糖特定基团的衍生化为出发点，成功实现了细胞外囊泡表面聚糖的衍生化和标记，结合高灵敏流式细胞仪能够对单个细胞外囊泡表面聚糖特征的异质性进行解析。
18、2、与现有的凝集素微阵列和凝集素印迹技术相比，本专利技术直接在单个细胞外囊泡水平对其表面聚糖进行检测，有效规避了样本中共存杂质对检测结果的干扰。
19、3、与现有的代谢糖工程技术相比，本专利技术无需使用糖类似物前体进行繁琐耗时的培养和标记，可直接对单个细胞外囊泡表面的聚糖进行原位标记，因而其适用范围广，可应用于多种细胞系来源、体液来源以及不可培养细胞来源细胞外囊泡表面聚糖的分析。
20、4、本专利技术在实现细胞外囊泡表面聚糖检测的基础上，可进一步研究细胞外囊泡表面聚糖在疾病发生和发展过程中的变化，能够为evs的基础研究和临床诊断提供新思路，带来新见解，提供新突破。
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1.一种单个细胞外囊泡表面聚糖的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述衍生化试剂选自NaIO4、半乳糖氧化酶和糖基转移酶。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述结合基团包括羟胺基团、叠氮基团、亲和素基团、炔烃基团、反式环辛烯基团、四嗪基团、抗体基团和受体基团中至少一种。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述炔烃基团包括双环[6.1.0]双炔基团、和二苯并环辛炔基团。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述指示基团包括荧光染料基团和功能蛋白基团。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述衍生化试剂选自NaIO4、半乳糖氧化酶和糖基转移酶；所述结合基团包括羟胺基团、叠氮基团、亲和素基团、炔烃基团、反式环辛烯基团、四嗪基团、抗体基团和受体基团中至少一种；所述指示基团包括荧光染料基团和功能蛋白基团。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述炔烃基团包括双环[6.1.0]双炔基团、和二苯并环辛炔基团。
8.如权
9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述衍生化试剂为NaIO4。
10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于：所述生物标签分子为XFDhydroxylamine荧光染料。
...【技术特征摘要】
1.一种单个细胞外囊泡表面聚糖的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述衍生化试剂选自naio4、半乳糖氧化酶和糖基转移酶。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述结合基团包括羟胺基团、叠氮基团、亲和素基团、炔烃基团、反式环辛烯基团、四嗪基团、抗体基团和受体基团中至少一种。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述炔烃基团包括双环[6.1.0]双炔基团、和二苯并环辛炔基团。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述指示基团包括荧光染料基团和功能蛋白基团。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在...
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