【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于中药、食品，尤其涉及北青龙衣多糖pjp80-ia制备方法及其应用。
技术介绍
1、青龙衣(pericarpium juglandis)为胡桃科植物胡桃楸jugland mandshuricamaxim和胡桃juglans regia l.的未成熟外果皮，主要分布在亚洲东北部。始载于《开宝本草》，在该书中将其称为胡桃青皮。《中华本草》和《中药大辞典》记载其味辛、苦；性平，微寒；有毒；归肝、肺、胃经。“青龙衣”之名始见于《山东中草药手册》，此后多延用此名。黑龙江药品监督管理局为与部颁品种青龙衣区别，而命名北青龙衣，又名胡桃青皮，胡桃壳，是野生山核桃未成熟的外果皮。作为黑龙江省道地药材，“北青龙衣”收录在《黑龙江省中药材标准》中，皱缩的半球形或不规则块片状，边缘多向内弯曲，直径3-6cm，厚约0.7cm。外表面黑棕色或黑黄色，较光滑。密生黄色斑点，一端有一果柄痕。内表面黑黄色，粗糙，附纵向筋络状维管柬。质脆，易折断。气微，味微苦，涩，嚼之有沙粒感。6-8月对未成熟的青胡桃皮进行采收，采集后洗净，削取果肉，即采即用。取原药材，除去杂质，及时晒干或低温干燥保存，是我国传统的民间用药。据《救急方》记载北青龙衣可被用做泡茶或泡酒饮用，起到止痛的功效，现代药理学表明其捣汁外涂，在治疗上火头痛和神经性皮炎方面也有不错疗效。我国的核桃产量和种植面积均居世界第一，其中核桃青皮呈碱性，自然降解对水体及土壤的影响不容小觑。因此，如何有效利用核桃青皮资源已成为亟需解决的问题。
2、青龙衣的主要化学成分包括醌类(例如萘醌类、蒽醌类、
3、多糖(polysaccharide)是生物体中维持生命活动的广泛存在的物质，是一类由醛糖或酮糖脱水聚合，通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，其分子式为(c6h10o5)n。根据单糖的组成，多糖分为同型多糖和杂多糖。前者由相同的单糖组成，后者由两个以上的单糖组成。根据来源，多糖可分为三种，即植物多糖、动物多糖和微生物多糖。目前分离出的活性多糖中，中药多糖占有一定比例，其组成中的单糖分子有葡萄糖(glc)、甘露糖(man)、半乳糖醛酸(gal a)、葡萄糖醛酸(glc a)、岩藻糖(fuc)和核糖(rib)等，中药多糖根据单糖种类、排列顺序、主链结构、有无支链及相对分子质量差异等产生不同的分子结构，不同结构决定多糖的各自性质进而影响其生物学活性，对应发挥的药理活性及作用机制也不尽相同。
4、北青龙衣具有药用价值，但目前研究基础薄弱，制约了北青龙衣的进一步开发利用。多糖传统热水提取法溶剂用量大、提取时间长、提取率低，不够高效节能。多糖中的杂质会对多糖的结构和活性研究造成影响，而初步提取的北青龙衣多糖中通常含有蛋白质、无机盐等大量杂质，因此有必要将其除去。常用方法有酶法、tca法和sevag法，酶法除蛋白虽然条件较温和，但是成本相对昂贵，不适合大规模应用；sevag法的主要原理是使多糖中的游离态蛋白质变性，形成不溶物质同时不会对多糖成分造成破坏，达到分离的效果。此外大多数天然多糖中都含有色素，对多糖后续结构和生物活性可能会产生影响，因此也需要将其除去。采用h2o2氧化法等化学法去除杂质可能会对多糖结构造成破坏。
技术实现思路
1、鉴于现有技术所存在的问题，本专利技术提供北青龙衣多糖pjp80-ia制备方法及其应用，通过选择合适的制备方法获得的北青龙衣多糖具有纯度高等优点，同时还具有免疫活性、抗肿瘤、抗氧化活性等。
2、本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
3、本专利技术提供北青龙衣多糖pjp80-ia的制备方法，包括以下步骤：采用闪氏提取法提取北青龙衣的上清液，采用分级醇沉的方法制备北青龙衣多糖，收集80％乙醇浓度醇沉后的沉淀，将其冷冻干燥，得到北青龙衣多糖pjp80。
4、采用上述方案的有益效果包括：本专利技术试验了不同乙醇浓度醇沉后的产物，发现80％乙醇浓度醇沉后产物获得的多糖含量更多、免疫活性更好。
5、进一步，北青龙衣的提取液的制备方法包括以下步骤：将北青龙衣的料液闪氏提取。
6、进一步，北青龙衣的料液包括北青龙衣粉末和水，北青龙衣粉末和水的料液比为1g:30ml，水的温度为90℃。
7、进一步，闪氏提取的参数包括：5000r/min，30s/次，提取2次。
8、采用上述方案的有益效果包括：具有提取时间短、高效、操作方便、节能等优点。
9、进一步，分级醇沉包括以下步骤：将北青龙衣的上清液抽滤后收集滤液；将滤液减压浓缩至原体积的1/3，加入95％乙醇，快速搅拌，使溶液中乙醇浓度达到20％，静置过夜，得到沉淀ⅰ和上清液ⅰ；重复上述步骤，在上清液ⅰ中加入乙醇，使溶液中乙醇终浓度达到40％，静置过夜，得到沉淀ⅱ和上清液ⅱ；重复上述步骤，在上清液ⅱ中加入乙醇，使溶液中乙醇终浓度达到60％，静置过夜，得到沉淀ⅲ和上清液ⅲ；重复上述步骤，在上清液ⅲ中加入乙醇，使溶液中乙醇终浓度达到80％，静置过夜，得到沉淀ⅳ和上清液ⅳ；将沉淀ⅳ用无水乙醇洗涤，冷冻干燥。
10、采用上述方案的有益效果包括：采用上述方法获得的北青龙衣多糖的多糖含量更高。
11、进一步，还包括脱色的步骤。
12、进一步，采用ab-8大孔树脂进行脱色。可以采用以下步骤：称取分级醇沉后获得的北青龙衣粗多糖溶解于蒸馏水中，加入ab-8大孔树脂，搅拌2h进行脱色，真空抽滤，将滤液冷冻干燥，北青龙衣粗多糖、蒸馏水、ab-8大孔树脂的比例为5g：100ml：50g。
13、采用上述方案的有益效果包括：采用上述方法可以去除提取物中的色素等杂质。
14、进一步，在脱色后，还包括deae-52阴离子交换层析柱分离纯化和sephadex g-50凝胶层析柱分离纯化步骤。
15、进一步，deae-52阴离子交换层析柱分离纯化包括以下步骤：活化deae-52纤维素；装柱、deae-52阴离子交换层析柱预处理；配制北青龙衣多糖溶液及上样；配制洗脱液及收集样品，以0-0.5mol/l nacl溶液作为洗脱液，每个浓度200ml，流速1ml/min、2ml/管收集洗脱液，收集nacl溶液浓度为0时获得的洗脱液，将其冷冻干燥，得到北青龙衣多糖pjp80-i。
16、进一步，sephadex g-50凝胶层析柱分离纯化包括以下步骤：活化sephadex g-50凝胶；装柱、sephadex g-50凝胶层析柱预处理；配制pjp80-i溶液及上样，洗脱液采用去离子水，流速1ml/3min，收集洗脱峰，将其冷冻干燥，得到北青龙衣多糖pjp80-ia。
17、采用上述方案的有益效果包括：采用上述方法可以进一步提高提取物中多糖的含量，经检测，北青龙衣多糖pjp80-ia糖含量可以达到97.51±0.19％。
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1.北青龙衣多糖PJP80-Ia的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将北青龙衣的上清液采用分级醇沉的方法提取，收集80％乙醇浓度醇沉后的沉淀。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，北青龙衣的上清液的制备方法包括以下步骤：将北青龙衣的料液闪氏提取。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，北青龙衣的料液包括北青龙衣粉末和水，北青龙衣粉末和水的料液比为1g:30mL，水的温度为90℃。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，闪氏提取的参数包括：5000r/min，30s/次，提取2次。
5.根据权利要求1-4任一项所述制备方法，其特征在于，分级醇沉包括以下步骤：将北青龙衣的上清液抽滤后，收集滤液；将滤液减压浓缩至原体积的1/3，加入95％乙醇，快速搅拌，使溶液中乙醇终浓度达到20％，静置过夜，得到沉淀Ⅰ和上清液Ⅰ；重复上述步骤，在上清液Ⅰ中加入乙醇，使溶液中乙醇终浓度达到40％，静置过夜，得到沉淀Ⅱ和上清液Ⅱ；重复上述步骤，在上清液Ⅱ中加入乙醇，使溶液中乙醇终浓度达到60％，静置过夜，得到沉淀Ⅲ和上清液Ⅲ；重复上述步
6.根据权利要求1-4任一项所述制备方法，其特征在于，还包括脱色的步骤；采用AB-8大孔树脂进行脱色包括以下步骤：称取分级醇沉后获得的北青龙衣粗多糖，溶解于蒸馏水中，加入AB-8大孔树脂，搅拌2h进行脱色，真空抽滤，将滤液冷冻干燥；北青龙衣粗多糖、蒸馏水、AB-8大孔树脂的比例为5g：100mL：50g。
7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，在脱色后，还包括DEAE-52阴离子交换层析柱分离纯化和Sephadex G-50凝胶层析柱分离纯化步骤。
8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，DEAE-52阴离子交换层析柱分离纯化包括以下步骤：活化DEAE-52纤维素；装柱、DEAE-52阴离子交换层析柱预处理；配制北青龙衣多糖溶液及上样；配制洗脱液及收集样品，以0-0.5mol/L NaCl溶液作为洗脱液，每个浓度200mL，流速1mL/min、2mL/管收集洗脱液，收集NaCl溶液浓度为0时获得的洗脱液，将其冷冻干燥，得到北青龙衣多糖PJP80-I。
9.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，Sephadex G-50凝胶层析柱分离纯化包括以下步骤：活化Sephadex G-50凝胶；装柱、Sephadex G-50凝胶层析柱预处理；配制PJP80-I溶液及上样，洗脱液采用去离子水，流速1mL/3min，收集洗脱峰，将其冷冻干燥，得到北青龙衣多糖PJP80-Ia。
10.北青龙衣多糖PJP80-Ia在(1)至(5)任一项或任几项中的应用，北青龙衣多糖PJP80-Ia采用权利要求1-9任一项所述制备方法制备；
...【技术特征摘要】
1.北青龙衣多糖pjp80-ia的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将北青龙衣的上清液采用分级醇沉的方法提取，收集80％乙醇浓度醇沉后的沉淀。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，北青龙衣的上清液的制备方法包括以下步骤：将北青龙衣的料液闪氏提取。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，北青龙衣的料液包括北青龙衣粉末和水，北青龙衣粉末和水的料液比为1g:30ml，水的温度为90℃。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，闪氏提取的参数包括：5000r/min，30s/次，提取2次。
5.根据权利要求1-4任一项所述制备方法，其特征在于，分级醇沉包括以下步骤：将北青龙衣的上清液抽滤后，收集滤液；将滤液减压浓缩至原体积的1/3，加入95％乙醇，快速搅拌，使溶液中乙醇终浓度达到20％，静置过夜，得到沉淀ⅰ和上清液ⅰ；重复上述步骤，在上清液ⅰ中加入乙醇，使溶液中乙醇终浓度达到40％，静置过夜，得到沉淀ⅱ和上清液ⅱ；重复上述步骤，在上清液ⅱ中加入乙醇，使溶液中乙醇终浓度达到60％，静置过夜，得到沉淀ⅲ和上清液ⅲ；重复上述步骤，在上清液ⅲ中加入乙醇，使溶液中乙醇终浓度达到80％，静置过夜，得到沉淀ⅳ和上清液ⅳ；将沉淀ⅳ用无水乙醇洗涤，冷冻干燥，得到北青龙衣多糖pjp80。
6.根据权利要求1-4任一项所述制备方法，其特征在于，还包括脱色的步骤；采用ab-8大孔树脂进行脱色包括以下步骤：称...
【专利技术属性】
技术研发人员：汲晨锋，王昊，侯兵乔，刘荣瑜，王迪，于建平，
申请(专利权)人：哈尔滨商业大学，
类型：发明
国别省市：
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