【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及外泌体mirna检测，特别是涉及一种检测外泌体mirna的电化学传感器及其制备方法与应用。
技术介绍
1、作为液体活检重要组成部分的外泌体(exosomes)是由细胞分泌的具有磷脂双分子层的纳米囊泡(直径30-100nm)，其能够通过其携带的生物大分子，介导细胞间通讯，参与机体的生理和病理过程。同时，受外泌体的脂质双层膜结构保护的蛋白、核酸等标志物更稳定，更易于储存检测。近年来多项研究证实肿瘤细胞来源外泌体mirna在肿瘤发生、发展过程中发挥重要作用，如mirna-21与乳腺癌转移密切相关，mirna-375可用于诊断乳腺癌，mirna-124介导肿瘤免疫逃逸等。因此，外泌体mirna可作为肿瘤液体活检的潜在新型生物标志物，辅助肿瘤早期诊断和个体化精准医疗。
2、目前，qrt-pcr是外泌体mirna定量检测的“金标准”，但qrt-pcr仍然存在耗时长，检测仪器昂贵和易导致假阳性等缺陷。近年来，已经开发出多种无需pcr反应的检测外泌体mirna生物传感方法，例如纳米材料辅助信号扩增方法，无酶dna纳米自组装，蛋白酶辅助的等温扩增方法等。其中，基于crispr/cas系统的外泌体mirna检测方法尤为受到关注。crispr是来源于细菌和古细菌中针对入侵核酸成分的适应性免疫系统，由于该系统的可编程性，现如今已成为转录调控、基因组编辑和核酸检测等方面的重要工具。特别是在crispr相关蛋白cas12a、cas13a的反式切割活性被发现之后，拓宽了其在核酸检测中的应用。crispr/cas12a，属于ii类v-
3、尽管crispr/cas12a在核酸检测方面具有很大潜力，但仍存在某些限制。首先，crispr效应器严格要求在dsdna目标序列上具有特征性的pam，从而限制了核酸分析的通用性。此外，单独的crispr/cas系统检测灵敏度不能满足外泌体低丰度mirna的检测需求，当前大多数方法依赖于pcr或rpa来扩增靶物质，需要复杂的引物设计和热循环等严格的反应条件，不利于即时检测。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中的问题，本专利技术的目的在于提供一种检测外泌体mirna的电化学传感器及其制备方法与应用。本方案创新地提出了一种多重级联链置换反应(multiplecascaded strand displacement amplification，mc-sda)介导crispr/cas12a系统的电化学传感器，外泌体mirna识别触发mc-sda扩增，生成大量单链激活dna，激活dna与cas12a-crrna复合物中crrna特异性结合后形成cas12a激活体，cas12a激活体反式切割金电极表面单链报告探针，通过检测电化学dpv信号实现对外泌体mirna的快速、高灵敏、高特异检测。将mc-sda的灵活可编程性与cas12a的功能相结合，成功构建了一个新的灵敏度高、特异性高、具有普适性的等温核酸电化学检测平台。
2、为实现本专利技术的目的，第一方面，本专利技术提供一种检测外泌体mirna的电化学传感器。
3、一种检测外泌体mirna的电化学传感器，其特征在于：将巯基和亚甲蓝标记的单链信号报告探针固定至金电极表面；将外泌体mirna、模板链t1、模板链t2、kf聚合酶、nt.bbvci限制性内切酶混合，孵育得mc-sda扩增产物；将mc-sda扩增产物与cas12a/crrna复合物混合，形成cas12a激活体；将cas12a激活体滴加到固定有信号报告探针的金电极表面，cas12a激活体反式切割信号报告探针，检测电化学dpv响应信号即可获知相应外泌体mirna含量。
4、本专利技术包括电化学传感界面构建：裸金电极表面固定亚甲蓝标记的单链dna信号报告探针；信号识别扩增：外泌体mirna识别触发mc-sda扩增出大量单链激活dna，与cas12a/crrna复合物结合形成cas12a激活体；信号转换输出：cas12a激活体反式切割金电极表面信号报告探针，检测电化学dpv信号变化即可获知相应外泌体mirna的含量。
5、进一步，所述电化学传感界面构建部分为先在裸金电极表面固定单链信号报告探针，而后进行封闭金电极非特异吸附位点所得。
6、进一步，信号识别扩增部分包括外泌体mirna、模板链t1、模板链t2、kf聚合酶、nt.bbvci限制性内切酶，模板链t1、t2上均设计两个nt.bbvci酶识别位点(b)，外泌体mirna(a)为引物，与t1结合后，在kf聚合酶和nt.bbvci限制性内切酶的作用下发生级联sda(c-sda)，生成c*和d*(单链激活dna)；c*又可作为引物与模板链t1结合，通过sda反应，生成大量d*；同时，c*也可与模板链t2结合，触发新一轮c-sda，生成大量a*和d*，a*与靶物质a的序列相同，又与模板链t1结合触发c-sda，从而实现多重级联sda(mc-sda)，并生成大量d*；d*与cas12a/crrna复合物中crrna特异性结合形成cas12a激活体。
7、进一步，信号转换输出部分包括cas12a激活体反式切割金电极表面亚甲蓝标记信号报告探针，亚甲蓝从电极表面分离，电极表面电活性物质减少，检测电化学dpv信号即可获知相应外泌体mirna含量。
8、进一步，所述单链信号报告探针的核苷酸序列为：
9、5'-tcagcgttcctttaccatttttttaacttatttggtttttttttt-3'(seq id no.1)；
10、所述信号报告探针的5'标记巯基基团，3'端标记亚甲蓝基团。
11、进一步，所述模板链t1探针的核苷酸序列为：
12、5’-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagctgaggaaccgctgaggtcaacatcagtctgataagcta-3’(seq id no.2)；
13、进一步，所述模板链t2探针的核苷酸序列为：
14、5’-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagctgaggtcaacatcagtctgataagctgaggaaccgctga-3’(seq id no.3)；
15、进一步，所述外泌体mirna(mir21)的核苷酸序列为：
16、5'-uagcuuaucagacugauguuga-3'(seq id no.4)；
17、进一步，所述crrna的核苷酸序列为：
18、5'-uaauuucuacuaaguguagauaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3'(seq id no.5)。
19、本专利技术第二方面提供一种如第一方面所述的检测外泌体mirna的电化本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测外泌体miRNA的电化学传感器，其特征在于：将巯基和亚甲蓝标记的单链信号报告探针固定至金电极表面；将外泌体miRNA、模板链T1、模板链T2、KF聚合酶、Nt.BbvCI限制性内切酶、dNTP混合，孵育得MC-SDA扩增产物；将MC-SDA扩增产物与Cas12a/crRNA复合物混合，形成Cas12a激活体；将Cas12a激活体滴加到固定有信号报告探针的金电极表面，Cas12a激活体反式切割电极表面信号报告探针，检测电化学DPV响应信号即可获知相应外泌体miRNA含量；
2.如权利要求1所述检测外泌体miRNA的电化学传感器的制备方法，包括如下步骤：
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中金电极抛光用粒度为0.05μm的氧化铝粉，所述的食人鱼溶液为浓H2SO4:H2O2，体积比为3:1。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，亚甲蓝标记信号报告探针的浓度为100-500nM。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中制备MC-SDA所用反应体系包括：1μL不同浓度的靶物质、
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中MC-SDA扩增反应时间为20-80min，模板链T1探针的浓度为50-500nM。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤5)中，反应体系包括：由步骤4)扩增得到的10μL单链激活DNA、4μL Cas12a/crRNA复合物、2μL 10×NEBuffer3.0缓冲液、0.5μL10U/μL RNase Inhabitor、3.5μL DEPC水。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤5)中，Cas12a/crRNA的复合物的浓度为50-500nM，孵育时间为10-60min。
9.一种检测外泌体miRNA的检测系统，权利要求1所述的电化学传感器用电化学工作站检测DPV信号，获得外泌体miRNA的含量。
10.如权利要求9所述的检测系统，其特征在于，包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种检测外泌体mirna的电化学传感器，其特征在于：将巯基和亚甲蓝标记的单链信号报告探针固定至金电极表面；将外泌体mirna、模板链t1、模板链t2、kf聚合酶、nt.bbvci限制性内切酶、dntp混合，孵育得mc-sda扩增产物；将mc-sda扩增产物与cas12a/crrna复合物混合，形成cas12a激活体；将cas12a激活体滴加到固定有信号报告探针的金电极表面，cas12a激活体反式切割电极表面信号报告探针，检测电化学dpv响应信号即可获知相应外泌体mirna含量；
2.如权利要求1所述检测外泌体mirna的电化学传感器的制备方法，包括如下步骤：
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中金电极抛光用粒度为0.05μm的氧化铝粉，所述的食人鱼溶液为浓h2so4:h2o2，体积比为3:1。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，亚甲蓝标记信号报告探针的浓度为100-500nm。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中制备mc-sda所用反应体系包括：1μl不同浓度的靶物质、1μl模板链t1探针、1μl模板链t2探针、1μl 10×nebuffer 2....
【专利技术属性】
技术研发人员：丁小娟，陈维贤，叶媛媛，李丹丹，杜燕娥，麦力，黄丽珍，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：
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