【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、类鼻疽是一种新出现的传染病，其在世界各地的热带地区被越来越多认识到。虽然已知该疾病在东南亚、南亚、中东、非洲、中美洲和南美洲的至少48个不同国家流行，但目前的模型预测该疾病可能在另外34个尚未报告的国家流行。类鼻疽的认识不足，部分原因是大多数病例发生在农村人口众多、微生物实验室能力有限的资源匮乏国家。由于类鼻疽的临床表现多种多样，从皮肤脓肿到急性肺炎和败血症，诊断可能很困难。2015年，估计全球人类类鼻疽总负担为约165,000例，其中约89,000人死亡，相当于麻疹，超过了钩端螺旋体病和登革热的感染水平，突显了该疾病在全球范围内的潜在影响。
2、类鼻疽的病原体假鼻疽伯克霍尔德氏菌(burkholderia pseudomallei)是一种兼性细胞内革兰氏阴性细菌，其可以从诸如流行地区的稻田、静水或死水以及潮湿土壤等环境生态位中分离出来。人类可以通过在职业或娱乐暴露期间的皮肤擦伤、吸入雾化灰尘或水中的细菌或摄入受污染的水进行经皮接种，获得假鼻疽伯克霍尔德氏菌感染。大多数自然感染发生在有一种或多种危险因素诸如糖尿病、酒精中毒、慢性肺病、慢性肾病或地中海贫血的个体中。
3、目前，类鼻疽的感染途径与临床表现之间的关系尚不明确。然而，最近的研究表明，在恶劣天气事件中吸入雾化的假鼻疽伯克霍尔德氏菌与肺炎之间存在联系。值得注意的是，超过一半的类鼻疽病例表现为可在轻度至严重疾病范围内的肺炎。
4、除了是一个重要的公共卫生问题外，假鼻疽伯克霍尔德氏菌还被认为是一种潜在的生物武器，目前被美国疾病
5、目前，还没有可用于类鼻疽免疫的人类疫苗。由于这些挑战，近年来开发防治类鼻疽的医疗对策已成为当务之急。然而，从伯克霍尔德氏菌物种中提取抗原的程序漫长、昂贵且难以扩大规模，因此很难提取疫苗所需的抗原量。为了大规模生产对抗类鼻疽或鼻疽病(glander)(一种由相关细菌鼻疽伯克霍尔德氏菌引起的传染病)的疫苗，需要一种从假鼻疽伯克霍尔德氏菌(b.pseudomallei)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(b.mallei)或相关伯克霍尔德氏菌物种中提取大量抗原的快速方法。
6、本领域需要一种从伯克霍尔德氏菌物种中提取大量多糖的快速且具有成本效益的方法。本专利技术满足了这些未满足的需求。
技术实现思路
1、本专利技术基于分离和纯化伯克霍尔德氏菌荚膜多糖的新方法的发现。该方法提供了高产率的均匀多糖材料。
2、在一个方面，提供了一种从伯克霍尔德氏菌物种分离和纯化荚膜多糖(cps)的方法，该方法包括(a)培养伯克霍尔德氏菌细胞；(b)将细胞沉淀(pellet)，将细胞重悬于水中，向重悬的细胞中添加醇以形成细胞浆液；(c)将细胞浆液沉淀，去除上清液；(d)向上清液中添加醇，形成包含cps的沉淀物；(e)将cps沉淀物沉淀，将沉淀物重悬于水中，透析重悬的cps沉淀物；(f)浓缩透析的cps沉淀物，将cps溶解在弱酸中，将溶解的cps与固体杂质分离；(g)浓缩溶解的cps，向浓缩的溶解的cps中添加缓冲液以形成溶液，将溶液加载到凝胶过滤树脂上；和(h)从凝胶过滤树脂中洗脱纯化的cps。
3、在一些实施方式中，伯克霍尔德氏菌物种是泰国伯克霍尔德氏菌(burkholderiathailandensis)。在一些实施方式中，伯克霍尔德氏菌物种是泰国伯克霍尔德氏菌的o-多糖突变菌株。在一些实施方式中，泰国伯克霍尔德氏菌的o-多糖突变体菌株是泰国伯克霍尔德氏菌bt2683。在一些实施方式中，cps是6-脱氧-庚烷cps。
4、在一些实施方式中，从伯克霍尔德氏菌物种分离和纯化荚膜多糖的方法的步骤(b)包括在搅拌下向重悬的细胞中添加与重悬的细胞的体积相比相等体积的乙醇以形成细胞浆液。
5、在一些实施方式中，方法的步骤(d)包括向上清液中添加乙醇以达到约90％(v/v)乙醇的最终浓度，形成包含cps的沉淀物。
6、在一些实施方式中，方法的步骤(e)包括用水透析重悬的cps沉淀物。
7、在一些实施方式中，方法的步骤(f)包括将cps溶解在包含约1体积％至3体积％的乙酸的水溶液中，以形成浓度为约2至7mg/ml cps的混合物。在一些实施方式中，将混合物在约100℃的温度下温育约2小时。
8、在一些实施方式中，方法的步骤(g)包括向浓缩的cps中添加磷酸盐缓冲盐水以形成cps浓度在约20至30mg/ml之间的溶液，并将该溶液加载到凝胶过滤树脂上，其中凝胶过滤树脂包括交联的葡聚糖凝胶过滤树脂。在一些实施方式中，步骤(g)包括向浓缩的cps中添加去离子水以形成cps浓度在约20至30mg/ml之间的溶液，并将该溶液加载到凝胶过滤树脂上，其中凝胶过滤树脂包括交联葡聚糖凝胶过滤树脂。
9、在一些实施方式中，方法的步骤(h)包括使用磷酸盐缓冲盐水从凝胶过滤树脂洗脱纯化的cps。在一些实施方式中，方法的步骤(h)包括使用去离子水从凝胶过滤树脂洗脱纯化的cps。在一些实施方式中，方法的步骤(h)之后是包括透析纯化的cps的步骤(i)。在一些实施方式中，将纯化的cps相对于水进行透析。
10、在一些实施方式中，方法的步骤(h)或步骤(i)之后是包括浓缩纯化的cps的步骤(j)。
11、在一些实施方式中，醇是乙醇。
12、在一个方面，本公开内容提供了通过任何上述方法分离和纯化的伯克霍尔德氏菌cps。在一些实施方式中，通过任何上述方法从o-多糖突变菌株泰国伯克霍尔德氏菌bt2683分离和纯化伯克霍尔德氏菌cps。在一些实施方式中，通过任何上述方法分离和纯化6-脱氧-庚烷cps。
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1.一种从伯克霍尔德氏菌物种中分离和纯化荚膜多糖(CPS)的方法，所述方法包括
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述伯克霍尔德氏菌物种是泰国伯克霍尔德氏菌。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述伯克霍尔德氏菌种是泰国伯克霍尔德菌的O-多糖突变菌株。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述泰国伯克霍尔德氏菌的O-多糖突变菌株是泰国伯克霍尔德氏菌BT2683。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述CPS是6-脱氧-庚烷CPS。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括在搅拌下向所述重悬的细胞中添加与所述重悬的细胞的体积相比相等体积的乙醇，以形成细胞浆液。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括向所述上清液中添加乙醇以达到约90％(v/v)乙醇的最终浓度，形成包含所述CPS的沉淀物。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中步骤(e)包括用水透析所述重悬的CPS沉淀物。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中步骤(
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述混合物在约100℃的温度下温育约2小时。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中步骤(g)包括向所述浓缩的CPS中添加磷酸盐-缓冲盐水以形成具有在约20至30mg/ml之间浓度的所述CPS的溶液，并将所述溶液加载到凝胶过滤树脂上，其中所述凝胶过滤树脂包括交联葡聚糖凝胶过滤树脂。
12.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中步骤(g)包括向所述浓缩的CPS中添加去离子水以形成浓度在约20至30mg/ml之间的所述CPS的溶液，并将所述溶液加载到凝胶过滤树脂上，其中所述凝胶过滤树脂包括交联葡聚糖凝胶过滤树脂。
13.根据权利要求11的方法，其中步骤(h)包括使用磷酸盐-缓冲盐水从所述凝胶过滤树脂洗脱纯化的CPS。
14.根据权利要求12所述的方法，其中步骤(h)包括使用去离子水从所述凝胶过滤树脂洗脱纯化的CPS。
15.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中步骤(h)之后是包括透析所述纯化的CPS的步骤(i)。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述纯化的CPS用水进行透析。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中步骤(h)或步骤(i)之后是包括浓缩所述纯化的CPS的步骤(j)。
18.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述醇为乙醇。
19.通过权利要求1-18中任一项所述的方法分离和纯化的伯克霍尔德氏菌CPS。
20.通过权利要求1-18中任一项所述的方法从O-多糖突变菌株泰国伯克霍尔德氏菌BT2683分离和纯化的伯克霍尔德氏菌CPS。
21.通过权利要求1-18中任一项所述的方法分离和纯化的6-脱氧-庚烷CPS。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种从伯克霍尔德氏菌物种中分离和纯化荚膜多糖(cps)的方法，所述方法包括
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述伯克霍尔德氏菌物种是泰国伯克霍尔德氏菌。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述伯克霍尔德氏菌种是泰国伯克霍尔德菌的o-多糖突变菌株。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述泰国伯克霍尔德氏菌的o-多糖突变菌株是泰国伯克霍尔德氏菌bt2683。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述cps是6-脱氧-庚烷cps。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括在搅拌下向所述重悬的细胞中添加与所述重悬的细胞的体积相比相等体积的乙醇，以形成细胞浆液。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括向所述上清液中添加乙醇以达到约90％(v/v)乙醇的最终浓度，形成包含所述cps的沉淀物。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中步骤(e)包括用水透析所述重悬的cps沉淀物。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中步骤(f)包括将所述cps溶解在包含按体积计在约1％至3％之间的乙酸的水溶液中，以形成cps浓度在约2至7mg/ml之间的混合物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述混合物在约100℃的温度下温育约2小时。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中步骤(g)包括向所述浓缩的cps中添加磷酸盐-缓冲盐水以形成具有在约...
【专利技术属性】
技术研发人员：P·J·布雷特，M·N·伯特尼克，
申请(专利权)人：雷诺内华达大学高等教育系统董事会，
类型：发明
国别省市：
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