【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶活力测定，尤其涉及一种神曲中酯酶的酶活力测定方法。
技术介绍
1、神曲，中药名。为面粉、麦麸、苦杏仁、赤小豆中混以青蒿、辣蓼、苍耳草的提取液发酵而成的曲剂。神曲中主要成分包括酵母菌和酶类等，这些成分主要作用是促进消化，因此对于消化不良、食欲不振、腹胀吐泻等症状有一定的治疗作用，还具有下气调中、健脾和胃的功效。
2、酯酶是一类催化酯水解反应的酶，其中酯是一种含有酯基的有机化合物。酯酶在生物体内广泛存在，包括微生物、植物和动物等。它们能够催化酯的加水分解反应，将酯分子分解为酸和醇。这个反应在生物体内有着重要的生理和代谢意义。在酯酶的研究中，目前还没有统一的测定方法，构建方便、准确的活力测定方法始终是一个难点，虽然己报道的测定方法很多，如滴定法、比色法、纸层析法、分光光度法和荧光法等。但这些方法中有的仪器设备要求高、步骤繁冗，有的灵敏度及稳定性较差；有的在测定中难以排除其它的干扰。
3、因此，获得一种稳定性好、准确性高、速度快、操作简便的神曲中酯酶的酶活力测定方法是非常必要的。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种神曲中酯酶的酶活力测定方法，选择隐绿原酸作为底物，通过计算酶水解隐绿原酸中酯键的物质的量来表征酯酶活力，所述测定方法准确性更好、速度快、稳定更强，操作更加简便。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种神曲中酯酶的酶活力测定方法，包括如下步骤：
4、
5、(2)将神曲样品处理后得到的酶液稀释，然后依次加入甲醇和隐绿原酸对照品溶液，保温、离心，获得空白对照溶液；
6、(3)对供试品溶液和空白对照溶液分别进行超高效液相色谱分析，得到以隐绿原酸标准溶液的浓度为横坐标、以峰面积a为纵坐标的标准曲线，并计算酯酶活力；
7、所述标准曲线为y＝ax+b；
8、所述酯酶活力计算公式为：
9、
10、其中a为标准曲线的斜率，b为标准曲线的截距；a0为空白对照溶液中隐绿原酸的峰面积；a30为反应结束后溶液中隐绿原酸的峰面积；v为从神曲中提取的酶液体积；m为神曲样品的质量；t为酶与底物的反应时间；m为隐绿原酸摩尔质量；n为酶液到供试品溶液的稀释倍数。
11、作为优选，步骤(1)所述神曲样品处理的操作为将神曲样品与水混合后保温、离心，收集上清为酶液。
12、作为优选，所述神曲样品与水混合的质量体积比为1g:(3-7)ml，保温时间为2-4h，所述离心的转速为10000-12000rpm，所述离心的时间为5-15min。
13、作为优选，步骤(1)中酶液稀释采用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液进行，所述酶液与磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液混合的体积比为1:(0.6-1.5)，所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的ph值为4.6-5.4。
14、作为优选，稀释后的酶液与隐绿原酸对照品溶液体积比为4:(0.1-0.5)。
15、作为优选，所述隐绿原酸对照品溶液的质量浓度为11-17μg/ml。
16、作为优选，步骤(1)中通过向反应液中添加甲醇终止反应，反应液与甲醇的体积比为0.25:(0.5-1)。
17、作为优选，步骤(2)所述保温的时间为20-40min，所述保温的温度为35-45℃；步骤(2)所述离心的时间为5-15min，所述离心的转速为11000-13000rpm。
18、作为优选，步骤(3)所述超高效液相色谱条件为：流动相为甲醇和体积浓度为0.05-0.15％的甲酸；流动相流速为0.3-0.8ml/min；检测波长为315-335nm。
19、作为优选，所述神曲样品是将神曲曲料经发酵、干燥处理后得到的。
20、作为优选，所述发酵的时间为5-10d，所述发酵的温度为30-38℃；所述干燥的时间为9-15h，所述干燥的温度为35-45℃。
21、通过采用上述技术方案，本专利技术具有如下有益效果：
22、本专利技术技术方案选择隐绿原酸作为底物，通过超高效液相色谱分析，得到空白溶液和供试品溶液中隐绿原酸的峰面积之差，采用外标法定量，求得隐绿原酸的减少量，从而间接测得酶水解隐绿原酸中酯键的物质的量来计算酯酶活力。本专利技术测定方法高效便捷，通过超高效液相色谱测定，可以在短时间内快速测定酯酶活力，而且所述测定方法准确性更好、速度快、稳定更强，操作更加简便。
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1.一种神曲中酯酶的酶活力测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的酶活力测定方法，其特征在于，步骤(1)所述神曲样品处理的操作为将神曲样品与水混合后保温、离心，收集上清为酶液；
3.根据权利要求1所述的酶活力测定方法，其特征在于，步骤(1)中酶液稀释采用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液进行，所述酶液与磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液混合的体积比为1:(0.6-1.5)，所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的pH值为4.6-5.4。
4.根据权利要求1所述的酶活力测定方法，其特征在于，稀释后的酶液与隐绿原酸对照品溶液体积比为4:(0.1-0.5)；所述隐绿原酸对照品溶液的质量浓度为11-17μg/mL。
5.根据权利要求1所述的酶活力测定方法，其特征在于，步骤(1)中通过向反应液中添加甲醇终止反应，反应液与甲醇的体积比为0.25:(0.5-1)。
6.根据权利要求1所述的酶活力测定方法，其特征在于，步骤(2)所述保温的时间为20-40min，所述保温的温度为35-45℃；
7.根据权利要求1所述的酶活力测定方法，
8.根据权利要求1所述的酶活力测定方法，其特征在于，所述神曲样品是将神曲曲料经发酵、干燥处理后得到的；
...【技术特征摘要】
1.一种神曲中酯酶的酶活力测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的酶活力测定方法，其特征在于，步骤(1)所述神曲样品处理的操作为将神曲样品与水混合后保温、离心，收集上清为酶液；
3.根据权利要求1所述的酶活力测定方法，其特征在于，步骤(1)中酶液稀释采用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液进行，所述酶液与磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液混合的体积比为1:(0.6-1.5)，所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的ph值为4.6-5.4。
4.根据权利要求1所述的酶活力测定方法，其特征在于，稀释后的酶液与隐绿原酸对照品溶液体积比为4:(0.1-0.5)；所述隐绿原酸对照品溶液的质量浓度为11-17μg/ml...
【专利技术属性】
技术研发人员：柴欣，单鲁豫，王跃飞，崔英，杨静，王萌，石亚玲，冶雅琳，
申请(专利权)人：天津中医药大学，
类型：发明
国别省市：
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