【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞生物学技术与应用，特别是涉及一种煤尘纳米颗粒暴露致肺损伤体外细胞模型及其构建方法和应用。
技术介绍
1、
2、肺泡上皮细胞作为保持肺稳态的主要细胞类型，在粉尘颗粒的刺激下早期会通过氧化应激、炎症、自身免疫反应、线粒体损伤、细胞内游离ca2+累积、微生态平衡和细胞代谢紊乱等造成急性呼吸系统损伤。而长期反复的急性损伤常常可发展为稳定的、持久性的且不可逆的严重损伤。近年来，研究报道外来颗粒物长期反复地破坏肺稳态而引发的重复性急性炎症可发展成持续性的慢性炎症，并且肺稳态的重复性破坏可诱发肺上皮细胞间充质表型转变，从而促进肺纤维化的发生与发展。然而，煤尘暴露致肺损伤的发生机制仍不明晰，如若不及早预防和治疗来控制疾病进展，将会出现不可逆的煤尘暴露致进行性大规模纤维化，最终导致患者呼吸衰竭乃至死亡。煤尘纳米颗粒是可吸入煤尘的重要组成部分，纳米粒子粒径小、表面积大等独特的理化特性可能使其成为限制煤尘暴露控制和降低煤工尘肺等煤尘暴露致肺损伤疾病防控效率的关键因素。此外，由于纳米粒子可随肺循环通过多种生物屏障到达全身各处，因此，煤尘纳米颗粒通过呼吸系统进入人体后还可累积全身免疫系统，造成多器官损伤。因此，对于煤尘暴露致肺损伤的作用机制研究以及相关新药的研发显得尤为重要。
3、目前，关于煤尘暴露致肺损伤的基础研究大多以动物模型为主，即通过非暴露式气管内注入法、暴露式气管内注入法、动静式口鼻吸入染尘(毒)法等给予适当剂量的煤尘注入小鼠肺部，建立动物煤尘暴露致肺损伤模型以进行后续实验，以动物体重、肺系数、肺组织病
4、肺泡上皮细胞是肺部受到外来颗粒物刺激的主要效应细胞之一。ⅱ型肺泡上皮细胞作为保持肺稳态的主要细胞类型，在粉尘颗粒的刺激下早期会通过氧化应激、炎症、自身免疫反应、线粒体损伤、细胞内游离ca2+累积、微生态平衡和细胞代谢紊乱等造成急性呼吸系统损伤。而长期反复的急性损伤常常可发展为稳定的、持久性的且不可逆的严重损伤。近年来，研究报道外来颗粒物长期反复地破坏肺稳态而引发的重复性急性炎症可发展成持续性的慢性炎症，并且肺稳态的重复性破坏可诱导ⅱ型肺泡上皮细胞发生间充质表型转变，从而促进肺纤维化的发生与发展。因此，以人原代ⅱ型肺泡上皮细胞(at2细胞)作为研究对象进行煤尘纳米颗粒暴露致肺损伤体外细胞模型构建具有代表性。本研究提供了一种建立煤尘纳米颗粒暴露致肺损伤体外细胞模型的方法，以人原代ⅱ型肺泡上皮细胞为研究对象，采用0.013μg/cm2的煤尘纳米颗粒暴露剂量处理不同时间后，在早期阶段采用cck-8实验检测细胞增殖、β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老、jc-1染色检测细胞凋亡来评价煤尘纳米颗粒暴露致细胞活性受损和毒性损伤程度，在晚期阶段采用倒置显微镜下观察细胞形态、划痕愈合实验检测细胞迁移能力、transwell实验检测细胞侵袭能力、western blot实验检测细胞间充质转变标志的蛋白表达水平来评价煤尘纳米颗粒暴露致细胞发生上皮间质转化的程度，最终获得了煤尘纳米颗粒暴露致肺损伤体外细胞模型。该细胞模型为煤尘暴露致肺损伤预防和治疗药物的研发以及煤尘暴露致肺损伤机制的研究提供了重要的技术支持。关于本专利技术提供的煤尘纳米颗粒暴露致肺损伤体外细胞模型构建方法及其应用目前还未见报道。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种煤尘纳米颗粒暴露致肺损伤体外细胞模型及其构建方法和应用。本专利技术所述构建方法具有造模周期短、操作简便、可重复性高、制作成本低的优点。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供一种煤尘纳米颗粒暴露致肺损伤体外细胞模型的构建方法，包括：
4、采用煤尘纳米颗粒暴露处理at2细胞后，进行消化传代培养6-24h，得到第二代at2细胞；对第二代at2进行煤尘纳米颗粒暴露处理和消化传代培养，得到第三代at2细胞；以消化传代培养和煤尘纳米颗粒暴露处理为一个循环，共循环10代，得到煤尘纳米颗粒暴露致肺损伤体外细胞模型；
5、以at2细胞的表面积计，所述煤尘纳米颗粒的暴露剂量为0.003-0.013μg/cm2/日；每次暴露处理的天数为3-5d。
6、优选的，所述at2细胞经复苏和消化传代培养获得。
7、优选的，所述消化传代培养采用的消化液为含0.20-0.25wt.％edta的胰蛋白酶细胞消化液。
8、优选的，所述消化传代培养采用的培养基为完全培养基。
9、优选的，所述消化传代培养一个循环的时间为78-144h。
10、本专利技术提供了一种上述构建方法构建得到的煤尘纳米颗粒暴露致肺损伤体外细胞模型。
11、本专利技术提供了上述的煤尘纳米颗粒暴露致肺损伤体外细胞模型在(1)和/或(2)中的应用，
12、(1)制备预防和治疗煤尘暴露致肺损伤疾病的药物；
13、(2)研究煤尘暴露致肺损伤疾病的发病机制。
14、优选的，所述煤尘暴露致肺损伤包括肺泡上皮细胞损伤、肺部组织炎症和肺部组织纤维化中的一种或几种。
15、优选的，所述肺泡上皮细胞损伤包括短期暴露损伤和/或长期暴露损伤。
16、优选的，所述短期暴露损伤包括煤尘纳米颗粒短期暴露致肺泡上皮细胞活性受损和毒性损伤；
17、所述长期暴露损伤包括煤尘纳米颗粒长期暴露致肺泡上皮细胞发生上皮间质转化。
18、本专利技术公开了以下技术效果：
19、本专利技术提供一种煤尘纳米颗粒暴露致肺损伤体外细胞模型的构建方法，包括：采用煤尘纳米颗粒暴露处理at2细胞后，进行消化传代培养6-24h，得到第二代at2细胞；对第二代at2细胞进行煤尘纳米颗粒暴露处理和消化传代培养，得到第三代at2细胞；以消化传代培养和煤尘纳米颗粒暴露处理为一个循环，共循环10代，得到煤尘纳米颗粒暴露致肺损伤体外细胞模型；以at2细胞的表面积计，所述煤尘纳米颗粒的暴露剂量为0.003-0.013μg/cm2/日；每次暴露处理的天数为3-5d。本专利技术所述构建方法具有造模周期短、操作简便、可重复性高、制作成本低的优点，克服了现有技术的缺陷：体内造模周期过长(通常需3个月以上)，对动物身体和心理产生较大影响，且受动物个体影响较大，可重复性较低，在致病机制研究方面广泛性、深入性和性价比均较低等。
20、本专利技术通过计算煤尘纳米颗粒每日暴露剂量，并在煤尘纳米颗粒暴露早期和晚期阶段检测肺损伤相关指标(外来颗粒物刺激细胞会发生早期阶段本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种煤尘纳米颗粒暴露致肺损伤体外细胞模型的构建方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述AT2细胞经复苏和消化传代培养获得。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述消化传代培养采用的消化液为含0.20-0.25wt.％EDTA的胰蛋白酶细胞消化液。
4.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述消化传代培养采用的培养基为完全培养基。
5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述一个循环的时间为78-144h。
6.一种利用权利要求1～5任一项所述构建方法构建得到的煤尘纳米颗粒暴露致肺损伤体外细胞模型。
7.权利要求6所述的煤尘纳米颗粒暴露致肺损伤体外细胞模型在(1)和/或(2)中的应用，其特征在于，
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述煤尘暴露致肺损伤包括肺泡上皮细胞损伤、肺部组织炎症和肺部组织纤维化中的一种或几种。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肺泡上皮细胞损伤包括短期暴露损伤和/或长期暴露
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述短期暴露损伤包括煤尘纳米颗粒短期暴露致肺泡上皮细胞活性受损和毒性损伤；
...【技术特征摘要】
1.一种煤尘纳米颗粒暴露致肺损伤体外细胞模型的构建方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述at2细胞经复苏和消化传代培养获得。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述消化传代培养采用的消化液为含0.20-0.25wt.％edta的胰蛋白酶细胞消化液。
4.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述消化传代培养采用的培养基为完全培养基。
5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述一个循环的时间为78-144h。
6.一种利用权利要求1～...
【专利技术属性】
技术研发人员：张殷慈，张医浩，周淑萍，刘新矿，蒋灿灿，陈倩，王鑫鑫，陈紫君，盛晓曼，
申请(专利权)人：安徽理工大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：
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