【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及干细胞冻存领域，具体涉及一种干细胞冻存保护剂。
技术介绍
1、干细胞功能较多，应用广泛，主要是进行细胞移植治疗，亦可作为一种理想的靶细胞用于基因治疗，同时在生物组织工程和免疫治疗中也有一定的应用。
2、目前，在干细胞冻存技术上，多采用二甲亚砜(10％)和胎牛血清蛋白(90％)的冻存液冷冻保存干细胞，同时也在开发其他合适的冻存液组分。但是，这些冷冻剂中高浓度组分的细胞毒性作用，如二甲亚砜不利于细胞的恢复，1，2-丙二醇、甘油替换二甲亚砜作为冷冻液，虽然降低了毒性，但是冻存效果比不上二甲亚砜，而且长时间的冻存干细胞的存活率较低。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种干细胞冻存保护剂。
2、为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种干细胞冻存保护剂，所述干细胞冻存保护剂包括自组装聚肽、半乳糖、山梨糖醇、1,2-丙二醇、二甲亚砜和胎牛血清蛋白；
3、所述干细胞冻存保护剂中各组分的比例如下：
4、所述1,2-丙二醇、二甲亚砜和胎牛血清蛋白的体积比为(2～5)：(0.5～1)：100；
5、所述自组装聚肽为聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-l-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-l-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-l-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-l-天门冬氨酸酯)；所述自组装聚肽的浓度为0.3～1g/l；
6、所述半乳糖的浓度为0.1～0.3mol/l；
7、所述山梨糖
8、专利技术人在研究干细胞冻存保护剂组分过程中，制备了自组装聚肽胶束，即聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-l-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-l-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-l-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-l-天门冬氨酸酯)，自组装聚肽胶束共聚物自组装形成了碗状核壳型粒子，聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-l-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-l-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-l-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-l-天门冬氨酸酯)组装体中，较为亲水的聚γ-苄基-l-谷氨酸酯或聚γ-苄基-l-天门冬氨酸酯或聚乙二醇-l-谷氨酸酯、聚乙二醇-l-天门冬氨酸酯刚性链段形成了外壳，较为疏水的聚苯乙烯链段形成了内核。聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-l-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-l-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-l-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-l-天门冬氨酸酯)内部的有机溶剂向外扩散，而水不能进入胶束内核，因此聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-l-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-l-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-l-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-l-天门冬氨酸酯)胶束发生塌缩形成纳米碗，在有机溶剂向外扩散时，胶束形貌不易变形。将聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-l-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-l-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-l-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-l-天门冬氨酸酯)应用在干细胞冻存保护剂中，避免了水分进入，而且可以使得多余的有机溶剂扩散出来，减少了冻存时有机溶剂、水的结冰而刺破细胞膜，可以更好的提高存活率，半乳糖、山梨糖醇能够调节干细胞内外的渗透压平衡，配合聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-l-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-l-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-l-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-l-天门冬氨酸酯)胶束的作用，调节1,2-丙二醇、二甲亚砜的扩散，将干细胞、1,2-丙二醇、二甲亚砜、半乳糖、山梨糖醇保护在聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-l-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-l-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-l-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-l-天门冬氨酸酯)胶束内部，并且通过扩散排除多余的1,2-丙二醇、二甲亚砜更好的调节干细胞内外的渗透压平衡，在冻存过程中，使得多余的1,2-丙二醇、二甲亚砜扩散排除，避免了有机溶剂结冰而刺破细胞膜。上述的干细胞冻存保护剂，能够延长干细胞冻存时间和冻存后干细胞的存活率。
9、优选地，所述聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-l-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-l-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-l-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-l-天门冬氨酸酯)的化学结构如式ⅰ所示：
10、
11、其中，a为50～80的整数，b为70～120的整数，c为50～100的整数，x为大于零的整数，y为大于零的整数，z1为5～20的整数，z2为5～20的整数。z1、z2可以相等也可以不相等。
12、将聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-l-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-l-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-l-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-l-天门冬氨酸酯)应用在冻存剂中，聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-l-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-l-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-l-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-l-天门冬氨酸酯)内部的有机溶剂向外扩散，而水不能进入胶束内核，因此聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-l-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-l-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-l-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-l-天门冬氨酸酯)胶束发生塌缩形成纳米碗，在有机溶剂向外扩散时，胶束形貌不易变形。将聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-l-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-l-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-l-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-l-天门冬氨酸酯)应用在干细胞冻存保护剂中，避免了水分进入，而且可以使得多余的有机溶剂扩散出来，减少了冻存时有机溶剂、水的结冰而刺破细胞膜，可以更好的提高存活率。且通过研究发现，a为50～80的整数，b为70～120的整数，c为50～100的整数时，疏水性的聚苯乙烯、亲水性的聚谷氨酸酯、亲水性的聚天门冬氨酸酯的链段比例使得胶束的结构更趋近碗型，在有机溶剂向外扩散时，胶束形貌不易变形，水不能进入胶束内核，搭配半乳糖、山梨糖醇、1,2-丙二醇、二甲亚砜更好的调节干细胞内外的渗透压平衡，延长干细胞冻存时间和冻存后干细胞的存活率。
13、优选地，30≤x+y≤50。
14、聚乙二醇酯化亲水性的聚谷氨酸酯、亲水性的聚天门冬氨酸酯的链段，使得碗型胶束的聚谷氨酸酯、聚天门冬氨酸酯的链段延伸，且30≤x+y≤50时，聚乙二醇酯化的比例使得有机溶剂更易向外扩散时，胶束形貌不易变形，水不能进入胶束内核，搭配半乳糖、山梨糖醇、1,2-丙二醇、二甲亚砜更好的调节干细胞内外的渗透压平衡，延长干细胞冻存时间和冻存后干细胞的存活率。
15、优选地，所述聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-l-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-l-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-l-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-l-天门冬氨酸酯)的制备方法包括以下步骤：
16、(1)制备聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-l-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-l-天门冬氨酸酯)；
17、(2)将聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-l-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-l-天门冬氨酸酯)与聚乙二醇单甲醚进行酯化反应，得到聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-l-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-l-谷氨酸酯)-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种干细胞冻存保护剂，其特征在于，所述干细胞冻存保护剂包括自组装聚肽、半乳糖、山梨糖醇、1,2-丙二醇、二甲亚砜和胎牛血清蛋白；
2.根据权利要求1所述干细胞冻存保护剂，其特征在于，所述聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)的化学结构如式Ⅰ所示：
3.根据权利要求1所述干细胞冻存保护剂，其特征在于，30≤x+y≤50。
4.根据权利要求1～3任一所述干细胞冻存保护剂，其特征在于，所述聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)的制备方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述干细胞冻存保护剂，其特征在于，制备聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯)的方法包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述干细胞冻存保护剂，其特征在于，所述谷氨酸5-苄酯N-羧基环内酸酐和L-天冬氨酸-4-苄酯
7.根据权利要求4所述干细胞冻存保护剂，其特征在于，所述步骤(2)中，将聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯)溶解在1,2-二氯乙烷中，浓度为10～15g/L，于50～60℃搅拌，依次加入催化剂对甲苯磺酸和聚乙二醇单甲醚，继续于50～60℃搅拌反应18～30小时，经N，N-二甲基甲酰胺和超纯水透析后冷冻干燥得到所述聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)。
8.根据权利要求7所述干细胞冻存保护剂，其特征在于，N，N-二甲基甲酰胺透析的时间为60～84小时，超纯水透析的时间为60～84小时。
9.根据权利要求4所述干细胞冻存保护剂，其特征在于，所述聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯)与聚乙二醇单甲醚的质量用量比例为1：5～20。
10.根据权利要求1所述干细胞冻存保护剂，其特征在于，所述干细胞冻存保护剂中，所述自组装聚肽的浓度为0.5～0.8g/L。
...【技术特征摘要】
1.一种干细胞冻存保护剂，其特征在于，所述干细胞冻存保护剂包括自组装聚肽、半乳糖、山梨糖醇、1,2-丙二醇、二甲亚砜和胎牛血清蛋白；
2.根据权利要求1所述干细胞冻存保护剂，其特征在于，所述聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-l-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-l-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-l-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-l-天门冬氨酸酯)的化学结构如式ⅰ所示：
3.根据权利要求1所述干细胞冻存保护剂，其特征在于，30≤x+y≤50。
4.根据权利要求1～3任一所述干细胞冻存保护剂，其特征在于，所述聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-l-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-l-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-l-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-l-天门冬氨酸酯)的制备方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述干细胞冻存保护剂，其特征在于，制备聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-l-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-l-天门冬氨酸酯)的方法包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述干细胞冻存保护剂，其特征在于，所述谷氨酸5-苄酯n-羧基环内酸酐和l-天冬氨酸-4-苄酯-n-羧基环内酸酐的摩尔比为(70～120)：(50～100)，所述胺基封端聚苯乙烯的质量用量为：谷氨酸5-苄酯n-羧基环内酸酐和l-天冬氨酸-4-苄酯-n-...
【专利技术属性】
技术研发人员：周璇，张马辉，刘淼，李松玉，
申请(专利权)人：南方医科大学珠江医院，
类型：发明
国别省市：
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