【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的检测方法，具体涉及一种植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法。
技术介绍
1、蛋白质是生命活动的直接体现者，泛素化是一种重要的蛋白质翻译后水平的加工机制，决定靶蛋白的降解/稳定、亚细胞定位或酶的活性。泛素化对靶蛋白的这种影响源于靶蛋白的泛素化修饰类型，目前研究较为广泛深入的主要有7种泛素化修饰类型，即k6、k11、k27、k29、k33、k48、k63，动物领域的研究结果表面给k48类泛素化修饰主要负责降解靶蛋白，k63类泛素化修饰主要负责保护靶蛋白，因此，对靶蛋白的泛素化修饰类型进行研究具有重要意义。
2、目前泛素化修饰类型的研究包括体外研究体系和体内研究体系，体外研究体系可以在动植物泛素化类型的研究中通用，但是由于费用昂贵、无法接近真实，因此开展动植物泛素化修饰类型的体内研究很有必要，目前，动物类体内研究体系已相对较为成熟，但尚没有植物体内泛素化修饰类型的研究体系。
技术实现思路
1、基于此，本专利技术的目的在于提供一种植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法，该方法可以快速的在植物体内进行，操作简单快速，实验周期短，且能同时实现泛素化类型及修饰强弱的确定。
2、本专利技术通过以下技术方案来实现上述技术目的：一种植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法，包括以下步骤：
3、(1)构建不同位点突变的泛素突变质粒并将其转化到农杆菌感受态中；
4、(2)构建靶蛋白质粒并将其转化到农
5、(3)将步骤(2)中的农杆菌感受态培养后的菌液分别与步骤(1)中的农杆菌感受态培养后的菌液混合，注射烟草叶片，1～3天后提取总蛋白进行wb-coip相对定量分析。
6、作为一种优选的实施方式，泛素突变质粒的构建采用的质粒为ph7lic10.1载体，靶蛋白质粒构建采用的质粒为ph7lic4.1载体或ph7lic8.1载体，农杆菌感受态为gv3101。
7、作为一种优选的实施方式，步骤(1)中的泛素突变为由赖氨酸突变为精氨酸。
8、作为一种优选的实施方式，提取总蛋白进行wb-coip相对定量分析的方法如下：收集注射后的烟草叶片并进行蛋白提取，吸取少量蛋白液加入样品缓冲液作为input样品，将剩余的蛋白液加入磁珠孵育，并洗脱后加入样品缓冲液作为ip样品，将input样品、ip样品90～110℃金属浴变性后跑胶检测，后经过转膜、封闭、抗体杂交、条带检测获得wb-coip胶图；
9、用imagej对wb-coip胶图中的蛋白条带进行灰度采集，计算coip效率及靶蛋白的相对灰度值并判断靶蛋白泛素化类型及修饰强弱。
10、作为一种优选的实施方式，相对灰度值＝样品中该基因实际灰度值/样品中内参基因实际灰度值，coip效率＝(rgip/rginput)m/(rgip/rginput)w，其中，公式中rgip，rginput分别指ip样品、input样品中某基因对应条带的相对灰度值，m、w分别代表突变型基因、野生型基因。
11、作为一种优选的实施方式，突变前后，靶蛋白的相对灰度值有变化，则判断受到该类型的泛素化修饰；
12、突变前后，coip效率值变大，说明该类型突变导致的靶蛋白富集泛素的效率越低，即靶蛋白受到该种类型的泛素化修饰越强。
13、作为一种优选的实施方式，烟草叶片的蛋白提取液包括150mm nacl、50mm ph 7.5的tris-hcl、5mm乙二胺四乙酸、1％m/v聚乙烯吡咯烷酮、10％v/v甘油、2mm二硫苏糖醇、10μl/ml植物蛋白酶抑制剂cpi。
14、作为一种优选的实施方式，野生型泛素基因的序列如seq id no:1所示。
15、作为一种优选的实施方式，泛素突变类型为k6r、k11r、k27r、k29r、k33r、k48r、k63r。
16、本专利技术所建立的在植物体内检测靶蛋白受到泛素化修饰类型及亲和力大小的方法，操作简单、廉价且实验周期短，不需要额外的试验条件及技术，特异性及准确性好，能够同时实现泛素化修饰类型的检测及亲和力大小的判断。
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1.一种植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法，其特征在于，泛素突变质粒的构建采用的质粒为pH7LIC10.1载体，靶蛋白质粒构建采用的质粒为pH7LIC4.1载体或pH7LIC8.1载体，农杆菌感受态为GV3101。
3.根据权利要求1所述的植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法，其特征在于，步骤(1)中的泛素突变为由赖氨酸突变为精氨酸。
4.根据权利要求1所述的植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法，其特征在于，提取总蛋白进行分析的方法如下：
5.根据权利要求4所述的植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法，其特征在于，
6.根据权利要求5所述的植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法，其特征在于，突变前后，靶蛋白的相对灰度值有变化，则判断受到该类型的泛素化修饰；
7.根据权利要求4～6任一项所述的植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法，其特征在于，烟草叶片的蛋白提取液包括15
8.根据权利要求1所述的植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法，其特征在于，野生型泛素基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
9.根据权利要求8所述的植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法，其特征在于，泛素突变类型为K6R、K11R、K27R、K29R、K33R、K48R、K63R。
...【技术特征摘要】
1.一种植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法，其特征在于，泛素突变质粒的构建采用的质粒为ph7lic10.1载体，靶蛋白质粒构建采用的质粒为ph7lic4.1载体或ph7lic8.1载体，农杆菌感受态为gv3101。
3.根据权利要求1所述的植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法，其特征在于，步骤(1)中的泛素突变为由赖氨酸突变为精氨酸。
4.根据权利要求1所述的植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法，其特征在于，提取总蛋白进行分析的方法如下：
5.根据权利要求4所述的植物体内检测靶蛋白泛素化类型及修饰强弱的方法，其特征在于，
6.根据权利要求5所述的植物体内检测靶...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶志彪，王文乾，张俊红，王涛涛，叶杰，张余洋，欧阳波，卢永恩，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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