【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业微生物，尤其涉及一种改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌及其应用。
技术介绍
1、目前，烤烟作为我国现代农业生产中的重要组成部分，在国民经济中占有十分重要的地位。烤烟是产量和品质并重的经济作物，但为追求烤烟高产，在农业生产过程中凸显多方面的问题。一方面，长期大量施用化肥导致烟叶产质量下降、土壤板结、土壤肥力下降等问题，成为烟叶生产可持续发展的瓶颈；另一方面，烤烟生产过程中普遍存在连作现象，而烤烟是对连作极为敏感的作物，许多研究表明，烤烟连作会造成土壤养分失衡、烟叶明显减产、烟叶质量下降、烟叶香气减少等问题。据统计，我国烤烟因连作每年带来的直接与间接经济损失达40亿元，严重威胁烤烟的可持续发展。因此，探究合理的施肥方法，提高烟叶品质，改良植烟土壤并关注施肥对生态环境的影响对于优质烤烟生产的可持续发展具有举足轻重的意义。
2、绿肥，作为一种重要的有机肥料，近年来在植烟区探索种植绿肥并适时翻耕还田的方式受到广泛关注。其中，有专利技术专利表明(申请号为201510175054.6)，掩埋箭筈豌豆绿肥后第二年种植烤烟可以提高植烟土壤养分、土壤微生物量和酶活性，提高烟叶质量，维护和改良土壤质量，促进烟区烤烟生产持续发展；有研究表明，在烤烟地冬闲时，种植绿肥既能充分利用光热资源和保墒，还能增加土壤中有机质含量。
3、我国绿肥资源种类丰富，分布广泛，这些绿肥共有98种，其中豆科72种，非豆科26种，栽培面积较大的有6科20属32种，其中豆科26种，非豆科6种。此外，研究表明，豆科绿肥的肥料价值和饲料价值均高于非
4、豆科绿肥需要与相应的根瘤菌互作以形成共生匹配关系，才能发挥共生固氮体系的优势。根瘤菌与豆科植物共生关系的建立，是细菌、植物和环境三方相互作用的结果，而不只是细菌与植物间的相互对话，且其共生关系因区域地理环境的差异而具有多样性。因此，不同地区应选择适宜的豆科绿肥作物，并接种与之相匹配的高效根瘤菌菌株，这样才能使其发挥更大的生物固氮作用，为现代农业提供更大的价值。前人的研究多集中于未接种匹配根瘤菌的绿肥翻压及配施化肥对烤烟生长及经济性状的影响，早先有针对烟田绿肥翻压的专利技术专利(申请号为201711362671.2；201510789710.1，201711433694.8(烟地轮作土壤中的应用))，但是豆科绿肥的种类众多，不同地区的土壤特性也有明显的差异，选择适宜的豆科绿肥作物，并接种与之相匹配的高效根瘤菌菌株，从而减少烟田化肥施用量的研究鲜有报道，因此展开豆科绿肥根瘤菌匹配性研究，可为四川烟区绿肥—烤烟轮作方式选择提供一定的指导作用。
5、在烟草生产中，可充分利用冬闲地以及光热资源，不用化肥，仅用高效根瘤菌接种生产优质豆科绿肥，翻压后改土培肥植烟土壤，进而为后期的烤烟生产达到化肥使用量零增长或减施化肥，并能提质增效作好科学的准备。早先有针对烟区轮作紫花苕子的专利技术专利(申请号为201210459188.7)，但是在绿肥生长过程中不是接种根瘤菌，而是用过磷酸钙、尿素，以促进绿肥生长，增大了生产成本，增加了环境压力。施用根瘤菌菌剂能促进豆科植物结瘤，有效提高豆科植物的产量，减少生产中的化肥使用量，降低生产成本，而且可以提高土壤肥力。豆科绿肥生产环节中仅接种根瘤菌，可以不施用任何肥料。但是，豆科绿肥接种根瘤菌的报道少，要提高根瘤菌的共生固氮作用，菌株和豆科植物品种是两个根本因素。根瘤菌的群体分布具有地理局限性，在根瘤菌的筛选中，需要注意对应用地区环境的适应能力。在某个区域内最为有效的根瘤菌往往来自本地区或者与本地区条件相似地区的菌株。因此，在根瘤菌选种时，不仅要考虑根瘤菌与豆科植物品种的匹配性，还必须重视菌剂应用的地域性。
6、现有技术1：一种改善稻田土壤肥力的大豆根瘤菌。这种大豆根瘤菌用于促进稻田土壤中的氮固定，增加土壤的氮含量。但是，它的鉴定方法仅基于形态学和生化特性。
7、技术问题1：
8、仅基于形态学和生化特性的鉴定不足以精确地鉴定微生物菌株，因为许多微生物在形态和生化特性上非常相似。
9、对于土壤中的氮固定，仅依靠大豆根瘤菌不足以达到理想的效果，尤其是在不同土壤类型和环境条件下。
10、现有技术2：一种用于增强植物生长的根瘤菌，该菌通过与植物根部共生，帮助植物吸收土壤中的矿物质和养分。但其鉴定方法仅基于其对植物生长的促进效果，而没有涉及到具体的遗传鉴定。
11、技术问题2：
12、仅基于对植物生长的促进效果进行鉴定导致无法明确区分不同的根瘤菌株，因为许多其他微生物或因素也促进植物生长。
13、在没有进行遗传鉴定的情况下，难以确定该根瘤菌的稳定性和适应性，尤其是在变化的环境条件下。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌及其应用。
2、本专利技术是这样实现的，一种改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌，改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌的菌株号为cp4-2，其分类命名为rhizobium anhuiense cp4-2，于2017年10月23日保藏于中国湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no： m 2017616。
3、本专利技术的另一目的在于提供一种实施所述的改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌的改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌鉴定方法，改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌鉴定方法包括以下步骤：
4、步骤一，从豌豆根瘤中分离和纯化根瘤菌，确定初选菌株；
5、步骤二，对初选菌株进行水培回接试验，得到目标菌株cp4-2；
6、步骤三，对目标菌株cp4-2分别进行抗逆性试验以及促生性试验；
7、步骤四，对目标菌株cp4-2进行基因扩增及系统发育分析，确定分类地位。
8、进一步，步骤一中，从豌豆根瘤中分离和纯化根瘤菌，选择具有典型的根瘤菌菌落特点，革兰氏染色结果为细胞呈小杆状、革兰氏阴性的菌株。
9、进一步，步骤二中，对初选菌株用目标地区的主栽豌豆品种进行水培回接试验，筛选出能结瘤且结瘤能力强、共生固氮效果好的菌株为目标菌株cp4-2。
10、进一步，步骤三中，对目标菌株cp4-2进行耐酸碱、耐盐和生长温度范围的抗逆性试验，以及分泌iaa能力、溶磷和溶钾能力的促生性试验。
11、进一步，步骤四中，对目标菌株cp4-2提取总dna，对多个持家基因进行测本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌，其特征在于，改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌的菌株号为CP4-2，于2017年10月23日保藏于中国湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2017616。
2.一种实施如权利要求1所述的改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌的改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌鉴定方法，其特征在于，改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌鉴定方法包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌鉴定方法，其特征在于，步骤一中，从豌豆根瘤中分离和纯化根瘤菌，选择具有典型的根瘤菌菌落特点，革兰氏染色结果为细胞呈小杆状、革兰氏阴性的菌株。
4.如权利要求2所述的改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌鉴定方法，其特征在于，步骤二中，对初选菌株用目标地区的主栽豌豆品种进行水培回接试验，筛选出能结瘤且结瘤能力强、共生固氮效果好的菌株为目标菌株CP4-2。
5.如权利要求2所述的改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌鉴定方法，其特征在于，步骤三中，对目标菌株CP4-2进行耐酸碱、耐盐和生长温度范围的抗逆性试验，以及分泌IAA能
6.如权利要求2所述的改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌鉴定方法，其特征在于，步骤四中，对目标菌株CP4-2提取总DNA，对多个持家基因进行测序，构建系统发育树，明确目标菌株CP4-2的分类地位。
7.一种改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌菌剂，其特征在于，改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌菌剂包含如权利要求1所述的改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌。
8.一种改善烟地轮作土壤的微生物肥料，其特征在于，改善烟地轮作土壤的微生物肥料包含如权利要求7～8任意一项所述的改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌菌剂。
9.一种如权利要求1所述的改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌和/或如权利要求7～8任意一项所述的改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌菌剂在制备改善烟地轮作土壤的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌，其特征在于，改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌的菌株号为cp4-2，于2017年10月23日保藏于中国湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 2017616。
2.一种实施如权利要求1所述的改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌的改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌鉴定方法，其特征在于，改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌鉴定方法包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌鉴定方法，其特征在于，步骤一中，从豌豆根瘤中分离和纯化根瘤菌，选择具有典型的根瘤菌菌落特点，革兰氏染色结果为细胞呈小杆状、革兰氏阴性的菌株。
4.如权利要求2所述的改善烟地轮作土壤的豌豆根瘤菌鉴定方法，其特征在于，步骤二中，对初选菌株用目标地区的主栽豌豆品种进行水培回接试验，筛选出能结瘤且结瘤能力强、共生固氮效果好的菌株为目标菌株cp4-2。
5.如权利要求2所述的改善...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐开未，陈远学，樊晓东，张艳琴，刘明，彭丹，刘志鹏，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：
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