【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于中药质量控制，具体涉及一种“谱-病-效-物”全息网络的核桃楸皮质量标志物筛选和控制方法及其应用。
技术介绍
1、中药核桃楸皮(cortex juglandis mandshuricae.)最早出自《中药志》，其味苦、辛，性微寒，具有清热燥湿、泻肝明目的功效，临床常用于肿瘤的治疗。核桃楸皮主要含有醌类、黄酮类、苷类等成分。有文献报道，核桃楸皮具有明确的体内防治肝肿瘤活性,与环磷酰胺比较,具有死亡率低、毒副作用小等优势。但核桃楸皮由于尚未被现行药典收录，导致其质量控制方法并不完善，特别是其质量标志物(quality marker，q-marker)的研究少之又少。中药质量标志物是刘昌孝院士及其团队提出的新概念，可理解为反映中药安全性和有效性的标示性物质。目前，中药质量标志物的研究方法主要基于指纹图谱、多元统计分析、网络药理学、分子对接以及药效筛选等手段进行。但这些单一方法或者多种方法联合主要还是基于中药化学成分含量及其药效活性进行筛选质量标志物，无法全面有效地反映中药材的质量。
2、因此，急需建立一套从疾病出发，以药效为导向，以活性物质筛选为目的，可全息映射中药质量的中药质量标志物筛选及控制方法。
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术提供一种“谱-病-效-物”全息网络的核桃楸皮质量标志物筛选和控制方法及其应用。通过“谱-病-效-物”全息网络筛选核桃楸皮质量标志物，可以全面清晰的映射核桃楸皮药材质量，且产品具有良好的抗肿瘤药效。此方法合理可行，可以弥补目前
2、为了实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案。
3、一种“谱-病-效-物”全息网络的核桃楸皮质量标志物筛选方法，包括如下步骤：
4、步骤(1)、谱-病：以临床上治疗肝癌疗效确切的核桃楸皮为研究对象，制得不同极性部位提取物，再以hplc法建立核桃楸皮不同极性部位的指纹图谱；
5、步骤(2)、病-效：cck-8法测定核桃楸皮不同极性部位对人肝癌hepg2细胞增殖抑制率的影响；
6、步骤(3)、效-物：分别以灰关联及偏最小二乘法分析核桃楸皮不同极性部位相关成分治疗肝癌的相关性；
7、步骤(4)、物-谱：uplc-qtof-ms/ms法分析鉴定核桃楸皮药效部位化学成分。
8、进一步地，所述步骤(1)具体为：
9、a.不同极性部位提取物制备：取核桃楸皮粉末适量，分别加入8倍量的乙酸乙酯、70％乙醇、正丁醇、氯仿、石油醚、水，加热回流提取1.5h，放冷，抽滤，浓缩至干，制得核桃楸皮不同极性部位提取物；
10、b.供试品溶液制备：精密称取各极性部位提取物0.2g，置于10ml容量瓶中，加少量甲醇溶解，再以甲醇定容至刻度，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，既得供试品溶液；
11、c.对照品溶液的制备：分别精密称取没食子酸、丁香酸、阿魏酸、鞣花酸、槲皮苷、柚皮素、山柰酚对照品适量，加甲醇制成浓度分别为没食子酸0.034mg/ml、丁香酸0.026mg/ml、阿魏酸0.009mg/ml、鞣花酸0.038mg/ml、槲皮苷0.030mg/ml、柚皮素0.022mg/ml、山柰酚0.017mg/ml的混合对照品溶液；
12、d.色谱条件：色谱柱为agilent poroshell sb-c18(4.6mm×100mm，2.7μm)；流动相为0.1％甲酸水(a)-甲醇(b)；梯度洗脱程序为0～2min，10％～15％b；2～4min，15～19％b；4～9min，19～36％b；9～12min，36～37％b；12～14min，37～38％b；14～30min，38～70％b；30～43min，70～87％b；43～55min，87～100％b；流速：0.6ml/min；柱温：30℃；进样量：5μl；检测波长：265nm；
13、e.指纹图谱的建立：精密吸取核桃楸皮各极性部位供试品溶液5μl，按步骤d色谱条件进样分析，得到核桃楸皮不同极性部位图谱；将各极性部位的色谱图导入到《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，标记保留时间相同的共有峰，若某极性部位在该保留时间下无峰，则将其峰面积记为0.01，得到24个共有峰的保留时间和峰面积。
14、进一步地，所述步骤(2)具体为：精密称取核桃楸皮各极性部位提取物，加dmso助溶，用dmem完全培养基配制成浓度为0.6mg/ml的含药培养液，过0.22μm微孔滤膜，即得含药培养液；取生长状态较好的人肝癌hepg2细胞，胰酶消化，离心，加dmem完全培养基配制成密度为1×105个/ml的细胞悬液，加入96孔板中，每孔100μl，放入37℃培养箱常规体外培养6-8h，待细胞贴壁完全后，设不同极性部位给药组和对照组，每组5个复孔，加入不同极性部位含药培养液作用24h，吸弃药液，每孔加入100μl含10％cck-8的完全培养基，放入37℃培养箱避光孵育2h后，用酶标仪测定各组细胞在450nm处的吸光度，实验重复3次；各组细胞增殖抑制率＝(1-待测组吸光度/对照组吸光度)×100％。
15、进一步地，所述步骤(3)具体为：
16、a.灰色关联度分析：从核桃楸皮不同极性部位的指纹图谱中筛选出分离度和对称因子较好的24个色谱峰；采用归一化法对数据进行无量纲化处理，将不同极性部位对人肝癌hepg2细胞增殖抑制作用的药效指标作为母序列，不同极性部位的共有峰峰面积作为子序列；采用grey modeling_v3.0软件进行分析，得出核桃楸皮不同极性部位色谱峰与体外药效学评价指标之间的关联系数；
17、b.偏最小二乘回归分析：为了进一步明确核桃楸皮化学成分和药效之间的相关性，将相关系数大于0.7的色谱峰峰面积作为自变量(x)，体外药效数据作为因变量(y)，导入simca-14.1软件进行偏最小二乘回归分析，综合回归系数和vip值两个指标，明确对药效贡献较大的化学成分为核桃楸皮治疗肝癌的药效物质。
18、进一步地，所述步骤(4)具体为：
19、a.供试品溶液制备：精密称取核桃楸皮药效部位提取物0.2g，置于10ml容量瓶中，加少量甲醇溶解，再以甲醇定容至刻度，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，既得；
20、b.色谱条件：色谱柱为agilent poroshell sb-c18色谱柱(4.6mm×100mm，2.7μm)；流动相：正离子模式下为0.1％甲酸水(a)-甲醇(b)，负离子模式下为水(a)-甲醇(b)；梯度洗脱程序：0～2min，10％～15％b；2～4min，15～19％b；4～9min，19～36％b；9～12min，36～37％b；12～14min，37～38％b；14～30min，38～70％b；30～43min，70～87％b；43～55min，87～100％b；流速：0.4ml/min；柱温：30℃；进样量：0.5μl；
21、c.质谱条本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种“谱-病-效-物”全息网络的核桃楸皮质量标志物筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种“谱-病-效-物”全息网络的核桃楸皮质量标志物筛选方法，其特征在于，所述步骤（1）具体为：
3.根据权利要求1所述的一种“谱-病-效-物”全息网络的核桃楸皮质量标志物筛选方法，其特征在于，所述步骤（2）具体为：精密称取核桃楸皮各极性部位提取物，加DMSO助溶，用DMEM完全培养基配制成浓度为0.6 mg/mL的含药培养液，过0.22 μm微孔滤膜，即得含药培养液；取生长状态较好的人肝癌HepG2细胞，胰酶消化，离心，加DMEM完全培养基配制成密度为1×105个/mL的细胞悬液，加入96孔板中，每孔100 μL，放入37℃培养箱常规体外培养6-8 h，待细胞贴壁完全后，设不同极性部位给药组和对照组，每组5个复孔，加入不同极性部位含药培养液作用24 h，吸弃药液，每孔加入100 μL含10%CCK-8的完全培养基，放入37℃培养箱避光孵育2 h后，用酶标仪测定各组细胞在450 nm处的吸光度，实验重复3次；各组细胞增殖抑制率=（1-待测组吸光
4.根据权利要求1所述的一种“谱-病-效-物”全息网络的核桃楸皮质量标志物筛选方法，其特征在于，所述步骤（3）具体为：
5.根据权利要求1所述的一种“谱-病-效-物”全息网络的核桃楸皮质量标志物筛选方法，其特征在于，所述步骤（4）具体为：
6.一种“谱-病-效-物”全息网络的核桃楸皮质量标志物控制方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的“谱-病-效-物”全息网络的核桃楸皮质量标志物控制方法，其特征在于，各质量标志物混合配伍抗肝癌药效应占有效部位的70%以上。
8.根据权利要求1-7任一项所述的一种“谱-病-效-物”全息网络的核桃楸皮质量标志物筛选方法及控制方法，其特征在于，筛选质量标志物合格的核桃楸皮对H22荷瘤小鼠具有明显的抑瘤作用。
...【技术特征摘要】
1.一种“谱-病-效-物”全息网络的核桃楸皮质量标志物筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种“谱-病-效-物”全息网络的核桃楸皮质量标志物筛选方法，其特征在于，所述步骤（1）具体为：
3.根据权利要求1所述的一种“谱-病-效-物”全息网络的核桃楸皮质量标志物筛选方法，其特征在于，所述步骤（2）具体为：精密称取核桃楸皮各极性部位提取物，加dmso助溶，用dmem完全培养基配制成浓度为0.6 mg/ml的含药培养液，过0.22 μm微孔滤膜，即得含药培养液；取生长状态较好的人肝癌hepg2细胞，胰酶消化，离心，加dmem完全培养基配制成密度为1×105个/ml的细胞悬液，加入96孔板中，每孔100 μl，放入37℃培养箱常规体外培养6-8 h，待细胞贴壁完全后，设不同极性部位给药组和对照组，每组5个复孔，加入不同极性部位含药培养液作用24 h，吸弃药液，每孔加入100 μl含10%cck-8的完全培养基，放入37℃...
【专利技术属性】
技术研发人员：孟宪生，张强，王诗蒙，王帅，包永睿，李天娇，
申请(专利权)人：辽宁中医药大学，
类型：发明
国别省市：
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