【技术实现步骤摘要】
本专利技术属林木种苗离体快繁生物，具体涉及一种利用香榧未成熟合子胚为外植体诱导胚性愈伤，通过液体悬浮系同步化调控及体细胞胚胎发生方式高效稳定再生香榧植株的方法。
技术介绍
1、香榧(torreyagrandisfort.)，又名中国榧，为红豆杉目(taxales)、红豆杉科(taxaceae)、榧树属(torreyaarn.)常绿乔木，是我国特有树种，主要生长在我国南方较为湿润的地区。香榧是榧树自然变异后经人工选择培育出的优良经济树种，具有很高的药用价值，如止咳化痰、润肺健脾等；种子含油率高达54.5％，是重要的木本油料树种；也能合成该属特征物质紫杉醇。目前，香榧主要通过嫁接繁育方式，但这种方式繁殖系数低，经营周期长，效率比较低，严重制约了香榧的人工栽培发展。所以有必要探索高效的香榧快繁产业化技术。目前，国内外通过组织培养技术来实现香榧良种壮苗快速繁殖报道较少，而通过传统器官发生方式很难诱导不定根。体细胞胚胎发生是体细胞模拟合子胚发育过程再生成具有完整植株再生能力的体胚，不存在单独的不定根诱导过程，而且能稳定遗传目标材料优良性状又可实现产业化生产的无性繁殖方法，具有周期短、效率高、成本低等特点。火炬松、挪威云杉、花旗松和辐射松等树种的体细胞胚诱导和植株再生已应用于较大规模的生产实践(mckeand etal.,2007；dean et al.,2008；find et al.,2014；lindgren et al.,2008)。
2、总的来说，香榧体细胞胚胎发生的研究尚处于起步阶段。已有报道采用香榧未成熟合子胚进行
3、本申请以香榧未成熟合子胚为外植体，诱导胚性愈伤组织，通过液体悬浮培养技术获得颗粒状原胚组织，再进行体细胞胚的诱导、成熟和萌发，实现植株再生，建立了稳定高效的香榧体胚发生体系，尚未有相关资料的报道。
技术实现思路
1、针对
技术介绍
中存在的当前香榧快速繁育技术体系构建的技术局限，本专利技术设计的目的在于提供一种稳定高效香榧香榧再生植株的建立方法。
2、具体通过以下技术方案加以实现：
3、一种稳定高效香榧再生植株的建立方法，该方法包括以下步骤：
4、1)香榧未成熟合子胚的采集与准备：每年6月底-7月初采集香榧优树生长发育良好、大小一致的种子，置于4℃冰箱冷藏保存，于一周内在无菌条件下剥取种子中的未成熟合子胚；
5、2)胚性愈伤组织诱导与增殖：在无菌条件下，将不同基因型香榧未成熟合子胚接种于胚性愈伤诱导培养基中，于25℃暗培养的条件下进行诱导培养，10-15天诱导出具有胚性胚柄团结构的胚性愈伤组织，30-40天获得稳定增殖的胚性愈伤组织；胚性愈伤的诱导效率在80％以上；
6、3)液体悬浮培养：在无菌条件下，取步骤2)获得的胚性愈伤组织，转入液体培养基中进行摇床暗培养，7天继代一次，2周后获得颗粒状原胚；
7、4)体细胞胚诱导与成熟：在无菌条件下，取步骤3)获得的原胚组织，转移到体细胞胚诱导培养基中，于25℃的温度条件下进行暗培养，1个月后就可以产生柱状胚，3个月左右体细胞胚完全成熟形成子叶胚；
8、5)体细胞胚萌发成苗：将步骤4)中的成熟子叶胚转移到萌发培养基萌发成苗，培养条件为：25±2℃光培养，光强45μmol·m-2·s-1，光周期16/8h；
9、6)体胚再生苗移栽：将步骤5)中培养的体胚苗开盖后放在驯化室360μmol·m-2·s-1的强光下炼苗一周，然后取出体胚苗，充分洗净根部的培养基后移栽到基质中，单株套袋以免过度蒸腾，定期浇水，一周后剪去塑料袋两角适当通风，两周后完全脱袋，三周能发新叶，长出新叶后就可移栽至温室。
10、进一步地，步骤1)中合子胚选用柱状胚。
11、进一步地，步骤2)中胚性愈伤诱导培养基配方为：gupta and durzan基本培养基，添加2,4-二氯苯氧乙酸2-4mg/l，6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/l，6-呋喃氨基嘌呤0.5mg/l，维生素c15mg/l，l-谷氨酰胺0.5g/l，水解酪蛋白0.5g/l，蔗糖20g/l，活性炭2g/l，水晶洋菜3.8g/l，ph5.8。
12、进一步地，步骤3)中胚性愈伤组织的暗培养条件为：温度23℃，摇床转速90rpm。
13、进一步地，步骤3)中液体培养基的配方为：dcr基本培养基，添加aba 1.0mg/l，赤霉素1mg/l，维生素c15mg/l，l-谷氨酰胺0.2g/l，水解酪蛋白0.5g/l，蔗糖30g/l，ph5.8。
14、进一步地，步骤4)中体细胞胚诱导培养基的配方为：dcr基本培养基，附加赤霉素3mg/l，维生素c10mg/l，l-谷氨酰胺0.5g/l，水解酪蛋白0.5g/l，蔗糖30g/l，活性炭1g/l，脱落酸3mg/l，聚乙二醇8000 0-200g/l，水晶洋菜3.8-4.5g/l，ph 5.8。
15、进一步地，步骤5)中萌发培养基配方为：dcr基本培养基，添加6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/l，3-吲哚丁酸0.2mg/l，赤霉素3mg/l，维生素c10mg/l，活性炭1g/l，蔗糖20g/l，水晶洋菜3.8g/l，ph5.8。
16、进一步地，步骤5)中的基质为泥炭:珍珠岩:蛙石按质量比1:1:1的比例混合而成的混合培养基质。
17、本专利技术的有益效果是：采用本专利技术方法香榧胚性愈伤诱导率最高可达88.9％，通过液体悬浮培养后，再经体胚诱导和成熟可获得成熟子叶胚，并能够再生植株，成功建立高效稳定的再生体系，为香榧优良种苗产业化生产创造了有利条件，为实现香榧遗传转化创制良种奠定了良好的基础。本方法繁殖系数高且不受季节的限制，实施步骤简单易行，效果非常显著。
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1.一种稳定高效香榧再生植株的建立方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种稳定高效香榧再生植株的建立方法，其特征在于步骤1)中合子胚选用柱状胚。
3.如权利要求1所述的一种稳定高效香榧再生植株的建立方法，其特征在于步骤2)中胚性愈伤诱导培养基配方为：Gupta and Durzan基本培养基，添加2,4-二氯苯氧乙酸2-4mg/L，6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/L，6-呋喃氨基嘌呤0.5mg/L，维生素C15mg/L，L-谷氨酰胺0.5g/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖20g/L，活性炭2g/L，水晶洋菜3.8g/L，pH5.8。
4.如权利要求1所述的一种稳定高效香榧再生植株的建立方法，其特征在于步骤3)中胚性愈伤组织的暗培养条件为：温度23℃，摇床转速90rpm。
5.如权利要求1所述的一种稳定高效香榧再生植株的建立方法，其特征在于步骤3)中液体培养基的配方为：DCR基本培养基，添加ABA 1.0mg/L，赤霉素1mg/L，维生素C 15mg/L，L-谷氨酰胺0.2g/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖30
6.如权利要求1所述的一种稳定高效香榧再生植株的建立方法，其特征在于步骤4)中体细胞胚诱导培养基的配方为：DCR基本培养基，附加赤霉素3mg/L，维生素C10mg/L，L-谷氨酰胺0.5g/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖30g/L，活性炭1g/L，脱落酸3mg/L，聚乙二醇8000 0-200g/L，水晶洋菜3.8-4.5g/L，pH 5.8。
7.如权利要求1所述的一种稳定高效香榧再生植株的建立方法，其特征在于步骤5)中萌发培养基配方为：DCR基本培养基，添加6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/L，3-吲哚丁酸0.2mg/L，赤霉素3mg/L，维生素C10mg/L，活性炭1g/L，蔗糖20g/L，水晶洋菜3.8g/L，pH5.8。
8.如权利要求1所述的一种稳定高效香榧再生植株的建立方法，其特征在于步骤5)中的基质为泥炭:珍珠岩:蛙石按质量比1:1:1的比例混合而成的混合培养基质。
...【技术特征摘要】
1.一种稳定高效香榧再生植株的建立方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种稳定高效香榧再生植株的建立方法，其特征在于步骤1)中合子胚选用柱状胚。
3.如权利要求1所述的一种稳定高效香榧再生植株的建立方法，其特征在于步骤2)中胚性愈伤诱导培养基配方为：gupta and durzan基本培养基，添加2,4-二氯苯氧乙酸2-4mg/l，6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/l，6-呋喃氨基嘌呤0.5mg/l，维生素c15mg/l，l-谷氨酰胺0.5g/l，水解酪蛋白0.5g/l，蔗糖20g/l，活性炭2g/l，水晶洋菜3.8g/l，ph5.8。
4.如权利要求1所述的一种稳定高效香榧再生植株的建立方法，其特征在于步骤3)中胚性愈伤组织的暗培养条件为：温度23℃，摇床转速90rpm。
5.如权利要求1所述的一种稳定高效香榧再生植株的建立方法，其特征在于步骤3)中液体培养基的配方为：dcr基本培养基，添加aba 1.0mg/l，赤霉素1mg/l，维生素c...
【专利技术属性】
技术研发人员：周小红，吴家胜，曹俊，王誉，姜筱雯，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：
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