【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体为嗜水气单胞菌ompts和aha 1亚单位疫苗的制备方法及应用。
技术介绍
1、嗜水气单胞菌(aeromonas hydrophila，ah)是一种人畜鱼共患的革兰氏阴性菌，其感染引起的细菌性败血症给水产养殖业造成了巨大的经济损失。目前，嗜水气单胞菌的全菌灭活疫苗、减毒活疫疫苗、以及菌体成分亚单位疫苗等方面均取得了一定的研究成果。其中，嗜水气单胞菌灭活疫苗于2011年已获生产批文，并在2020年又重新核发批文。
2、嗜水气单胞菌灭活疫苗的制备过程具体为：先从患病鱼体分离致病性嗜水气单胞菌菌株，经菌株鉴定和回感试验后筛选最佳的培养和灭活条件，经无菌检验和安全检验合格后免疫试验鱼，从而检测并确定灭活疫苗的免疫保护效果。灭活疫苗虽然对特定毒株具有较好的免疫保护作用，然而嗜水气单胞菌血清型较多，不同地区和养殖动物分离的菌株具有明显差异，从而限制了灭活疫苗的广谱性免疫保护效果及其应用范围。
3、减毒活疫苗是在保留免疫原性的基础上进行降毒处理，只引起机体产生免疫反应而不致病的一类疫苗。嗜水气单胞菌减毒疫苗，即通过改变培养条件，或在异种动物体内传代，使其毒力减弱，或利用基因工程技术敲除其基因组中毒力相关基因的某一片段，使其成为毒力因子缺失的突变体而制成减毒疫苗。减毒疫苗虽然具有免疫原性强、作用时间长、价格低廉等优点。然而，减毒疫苗的缺点是制备相对复杂、存在一定的毒力残留、具有感染风险、且保存和运输时需要冷藏处理，因此目前嗜水气单胞菌减毒疫苗相关的研究报道较少。
4、渔用核酸疫苗中研究
5、与灭活疫苗、减毒活疫苗及核酸疫苗等渔用疫苗相比，亚单位疫苗具有免疫保护效率高、持续性强等优势。亚单位疫苗是通过分离、纯化或体外表达病原体的免疫原性成分制备而成的特异性抗原，如外膜蛋白、脂多糖、类毒素、外毒素等，对宿主不存在致病风险。嗜水气单胞菌的多种外膜蛋白都具有较高的免疫原性，可以激活鱼类的体液免疫和细胞免疫，同时在不同菌株中的保守性较高，是制备具有广谱性免疫保护效果嗜水气单胞菌疫苗的理想抗原，为此提供了嗜水气单胞菌ompts和aha 1亚单位疫苗的制备方法及应用。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是针对现有技术的缺陷，提供嗜水气单胞菌ompts和aha 1亚单位疫苗的制备方法及应用，以解决上述
技术介绍
提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：嗜水气单胞菌ompts和aha1亚单位疫苗的制备方法，具体步骤如下：
3、s1：嗜水气单胞菌ompts和aha 1的重组表达载体构建与转化；
4、s11：设计引物：根据嗜水气单胞菌ompts基因序列(genbank登录号：af276639.2)及aha1基因序列(genbank登录号：ay165026.1)预测其跨膜结构及信号肽位置并且设计引物；
5、s12：目的基因的克隆；
6、挑取低温保存的嗜水气单胞菌接种于lb液体培养基中，置于28℃恒温摇床，培养12h后，取10ml菌液，8000g，离心10min收集菌体；
7、使用《细菌基因组dna提取试剂盒》提取菌体dna，将提取的dna作为模板扩增目的基因，通过pcr扩增出目的基因，其反应条件为94℃预变性5min，94℃预变性1min，56℃预变性1min，72℃预变性2min，共30个循环，最后72℃延伸10min，通过凝胶电泳检测扩增效果；pcr反应体系如下：
8、成分和体积为10×buffer为1.0μl；dntp为0.4μl；f为0.2μl；r为0.2μl；taq酶为0.15μl；细菌dna为1.5μl；ddh2o为6.55μl；total为10.0μl。
9、s13：构建重组质粒；
10、琼脂糖凝胶电泳分离出的目的条带，使用axygendna凝胶回收试剂盒回收目的基因ompts和aha 1，并构建重组质粒t-ompts和t-aha 1；
11、构建重组质粒的反应体系为：5μl 2×buffer，1μlt vector，3μl胶回收产物，1μlt4连接酶；反应条件为：23℃反应30min，置于4℃过夜，将构建好的质粒转入trans5α并鉴定；
12、s131：取10μl连接产物加入大肠杆菌trans5α，温和混匀，冰浴静置30min，42℃水浴热激90s，再立即冰浴静置3min；
13、s132：取80μl转化后的菌液加入到800μl lb培养基中，37℃，180rpm，培养1h，恢复菌体抗药性；
14、s133：向含卡那霉素的lb琼脂平板培养基上加入40μlx-gal、5μl iptg、200μl菌液，避光均匀涂布；
15、s134：将平板置于恒温培养箱培养16h，再置于4℃培养使蓝色充分显现，挑取白色菌落置于含氨苄的lb液体培养基中，37℃，180rpm，培养8h；
16、s135：取适量菌液作为模板进行pcr验证，并将阳性克隆测序；
17、s14：构建重组表达载体；
18、将测序检测后的菌液扩培，使用《tiangen高纯度质粒小提中量试剂盒》提取质粒，并检测其浓度，再进行重组质粒与pet-28a的分别双酶切，并电泳检测酶切效果，胶回收构建完成的重组表达载体pet-28a-ompts和pet-28a-aha1；
19、载体与质粒双酶切体系的成分和体积如下：10×tango buffer的体积为6μl；t-ompts/pet-28a的体积为30μl；bamh i的体积为0.2μl；xho i的体积为0.2μl；ddh2o的体积为23.6μl；total的体积为60μl；反应条件：37℃过夜；
20、载体与质粒连接体系的成分和体积如下：10×t4 dnaligase buffer的体积为0.5μl；peg400的体积为0.5μl；t4 dnaligase的体积为0.5μl；ompts酶切产物的体积为3μl；pet-28a酶切产物的体积为1μl；total的体积为5.5μl；反应条件：23℃反应30min，4℃连接过夜；
21、s15：重组表达载体转化感受态细胞(bl21(de3)；
22、按照转化trans5α的方法将重组表达载体转入表达菌株bl21(de3)；
23、s2：重组蛋白的诱导表达及纯化；
24、s21本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.嗜水气单胞菌OmpTS和Aha 1亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的嗜水气单胞菌OmpTS和Aha 1亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：所述S21中的IPTG终浓度为0，0.02，0.05，0.20，0.50，1.00mM。
3.根据权利要求1所述的嗜水气单胞菌OmpTS和Aha 1亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：所述S43的具体步骤如下：
4.根据权利要求1所述的嗜水气单胞菌OmpTS和Aha 1亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：所述S44中通过ELISA方法检测血清中特异性抗体(IgM+)水平，具体步骤如下：
5.一种如权利要求1所述的嗜水气单胞菌OmpTS和Aha 1亚单位疫苗在预防团头鲂感染嗜水气单胞菌中的应用。
【技术特征摘要】
1.嗜水气单胞菌ompts和aha 1亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的嗜水气单胞菌ompts和aha 1亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：所述s21中的iptg终浓度为0，0.02，0.05，0.20，0.50，1.00mm。
3.根据权利要求1所述的嗜水气单胞菌ompts和aha 1亚单位疫苗...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁祝进，徐泽华，张敏颖，张婷，赵晓恒，程汉良，许建和，陈香凝，
申请(专利权)人：江苏海洋大学，
类型：发明
国别省市：
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