【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及到一种桃成分快速检测试剂盒。
技术介绍
1、桃系蔷薇科李属桃亚属果树植物，属于大宗类水果，也是我国的重要水果生产和供应类型。因桃果产量较高，价格低，风味鲜美，在经济利益驱动下易掺杂入其他高价值的果汁中，损害消费者权益。更重要的是，据国内外人群过敏反应的研究结果显示，桃居于致敏水果排行榜之首。若水果制品或其他食品中存在桃的掺杂掺假，桃中含有的过敏成分势必会威胁到消费者的健康，因此建立并形成过敏源桃成分的快速检测方法和试剂盒具有重要意义。
2、随着分子生物学技术的迅速发展，基于dna的方法显示具有良好的可检测性、特异性和稳定性等优势。基于dna的桃成分鉴定和检测方法主要有传统的pcr、实时荧光pcr和微滴数字pcr，目前这些技术成熟并已形成了金标准方法。基于实验室分析技术的补充工具，等温扩增技术(rpa、lamp、raa等)在恒温条件下即可核酸扩增，相较于传统pcr技术，大大减少对昂贵仪器设备的依赖，并简化检测步骤和时间。但是该方法仍存在一些局限性，比如非特异扩增、气溶胶污染、假阳性等，影响快速检测结果准确性。
3、基于crispr/cas12a的检测系统因其高灵敏度和特异性而被广泛应用。cas12a蛋白是一种单rna引导的核酸内切酶，可以切割双链dna，触发非靶单链dna的反式切割。使用荧光团猝灭剂(fq)标记的ssdna可以获得实时荧光信号。此外，当与等温扩增技术结合使用时，检测方法具有双特异性的优势，保证了检测结果的准确性，使检测更加简便快捷。crispr/cas技
技术实现思路
1、本专利技术的目的是解决桃成分掺假混杂导致的食物过敏现象，提供检测水果制品中桃成分的crrna引物，进一步设计成快速检测试剂盒，具有快速、灵敏、特异、不依赖大型仪器、操作简便等优势，可适用于现场鉴定，对桃成分的鉴定具有重要意义。
2、为实现上述的目的，本申请采取了以下技术解决思路：
3、本专利技术第一方面提供一种基于raa-crispr/cas12a技术快速检测桃成分的crrna引物，所述引物的序列如下：
4、crrna-matk-3：uaauuucuacuaaguguagaguuagaagcauuagcggaaa
5、(seq id no.3)。
6、本专利技术第二方面提供一种基于raa-crispr/cas12a技术快速检测桃成分的raa引物，所述引物的序列如下：
7、上游引物raa-matk-11f：tctaaggaagatactaatcgtagggaaaac(seq id no.14)；以及
8、下游引物raa-matk-11r：gttggataatgtaggttatgataataaatctag(seq id no.15)。
9、本专利技术的第三方面提供一种基于raa-crispr/cas12a技术快速检测桃成分的试剂盒，所述试剂盒包括上述crrna引物、上述raa引物、cas12a蛋白、荧光报告基因标记的fq-ssdna和nebuffer2.1缓冲液。
10、优选的，所述荧光报告基因标记的fq-ssdna为holmes ssdna reporter(fam)(tolobio公司)，其为单链dna寡核苷酸探针，5’端标记fam荧光报告基团(reporter)，3’端标记荧光淬灭基团(quencher)。
11、本专利技术第四方面提供上述crrna引物、上述raa引物或上述试剂盒在水果制品中桃成分快速检测中的应用。
12、优选的，本专利技术提供上述crrna引物、上述raa引物或上述试剂盒在制备用于快速检测水果制品中桃成分的试剂中的应用。
13、优选的，所述水果制品为果汁、果酱或果干。
14、优选的，所述水果制品中的桃成分基因组dna的浓度不低于10-2ng/μl。
15、本专利技术第五方面提供一种快速检测水果制品中桃成分的方法，包括以下步骤：
16、(1)dna提取：提取果汁样品中的基因组dna；
17、(2)raa扩增：以步骤(1)提取的基因组dna为模板进行raa等温扩增，得到扩增产物；其中raa引物序列如下：
18、上游引物raa-matk-11f：tctaaggaagatactaatcgtagggaaaac(seq id no.14)；以及
19、下游引物raa-matk-11r：gttggataatgtaggttatgataataaatctag(seq id no.15)；
20、(3)crispr/cas12技术检测：将所述raa扩增产物与crrna引物、cas12a蛋白、nebuffer 2.1缓冲液、荧光报告基因fq-ssdna和无核酶水充分混合，孵育，得到crispr/cas12a荧光切割反应产物；其中crrna引物的序列如下：
21、crrna-matk-3：uaauuucuacuaaguguagaguuagaagcauuagcggaaa(seq id no.3)；
22、(4)荧光可视化结果读取：将所述反应产物测定荧光强度，根据荧光强度的有无判断水果制品中是否含有桃成分：当检测到荧光强度信号时，表明水果制品中含有桃成分，反之则不含。
23、优选的，采用天根深加工食品dna提取试剂盒提取果汁样品中的基因组dna。
24、优选的，raa扩增时的上游引物和下游引物终浓度均为30μmol/l，基因组dna模板浓度为60ng。
25、优选的，raa扩增时的孵育温度为37℃，孵育时间为20min。
26、优选的，raa等温扩增体系如下：
27、 组分 体积μl 缓冲液v 25 引物f(10μm) 2 引物r(10μm) 2 纯化水 12.5 总体积 41.5
28、。
29、优选的，使用江苏奇天基因生物科技公司生产的raa核酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于RAA-CRISPR/Cas12a技术快速检测桃成分的crRNA引物，其特征在于，所述引物的序列如下：
2.一种基于RAA-CRISPR/Cas12a技术快速检测桃成分的RAA引物，其特征在于，所述引物的序列如下：
3.一种基于RAA-CRISPR/Cas12a技术快速检测桃成分的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的crRNA引物、权利要求2所述的RAA引物、Cas12a蛋白、荧光报告基因标记的FQ-ssDNA和NEBuffer 2.1缓冲液。
4.权利要求1所述的crRNA引物、权利要求2所述的RAA引物或权利要求3所述的试剂盒在水果制品中桃成分快速检测中的应用。
5.一种快速检测水果制品中桃成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中RAA扩增时的孵育温度为37℃，孵育时间为20min。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中RAA扩增时的RAA-matK-桃上游引物和RAA-matK-桃下游引物终浓度均为
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中Cas12a与crRNA的摩尔浓度比为1:2。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中Cas12a与荧光标记报告基因FQ-ssDNA的摩尔浓度比为1:7.5。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中CRISPR/Cas12a技术检测时的孵育温度为37℃，孵育时间为30min。
...【技术特征摘要】
1.一种基于raa-crispr/cas12a技术快速检测桃成分的crrna引物，其特征在于，所述引物的序列如下：
2.一种基于raa-crispr/cas12a技术快速检测桃成分的raa引物，其特征在于，所述引物的序列如下：
3.一种基于raa-crispr/cas12a技术快速检测桃成分的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的crrna引物、权利要求2所述的raa引物、cas12a蛋白、荧光报告基因标记的fq-ssdna和nebuffer 2.1缓冲液。
4.权利要求1所述的crrna引物、权利要求2所述的raa引物或权利要求3所述的试剂盒在水果制品中桃成分快速检测中的应用。
5.一种快速检测水果制品中桃成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：
6...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈颖，邢冉冉，王琳，张九凯，邓婷婷，于宁，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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