富营养化水体中浮游植物叶绿素ａ的分析测定方法，是提取、分析并测定富营养化水体中浮游植物的叶绿素ａ的一种新方法，涉及环境工程水环境修复技术领域。将采集的水样，依次经过抽滤、冷冻后，加入热乙醇，水浴、超声后避光萃取若干小时，然后离心取上清液，采用分光光度法测定水体中叶绿素的含量。本发明专利技术样品提取及测定操作简单、快捷，能最大程度的提取浮游植物中的叶绿素，萃取程度高、低毒害、准确性好、检测限低、检测浓度范围广，解决了传统研磨法叶绿素流失程度高，萃取效率低，使用丙酮萃取对人体有一定的毒性的缺陷，适用于富营养化水体中浮游植物叶绿素的快速提取和准确测定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于环境工程水环境修复
，尤其涉及一种富营养化水体中浮游植 物叶绿素a的分析测定方法，是提取、分析并测定富营养化水体中浮游植物的叶绿素a的一 种新方法。
技术介绍
绿色植物利用叶绿素进行光合作用，叶绿素主要有叶绿素a和叶绿素b两种，属于 合成天然低分子有机化合物，不溶于水，而溶于有机溶剂，如乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等。其中 叶绿素a可直接反映水体中藻类的生长情况，含量高，则藻类多，含量低，则藻类少。过多的 藻类使得水体透明度和溶解氧降低，影响水表面下生物进行光合作用，造成水质恶化，加速 水体老化，是促使水体富营养化的重要原因。因此，叶绿素a是反映水体富营养化的重要指 标，测定水体中叶绿素a的浓度，对控制水体富营养化程度，恢复水环境功效具有重要的作 用。当水体中叶绿素a的浓度在25 500ug/L时，可作为水体富营养化的依据之一。对水体中藻类及其它浮游植物叶绿素a的测定，目前方法众多，一般使用较多的 为研磨法，该方法需要将过滤、冷冻后的植物组织加入适量90%丙酮，而后充分研磨，在研 磨过程中易造成组织中叶绿素的流失，而丙酮对人体有一定的毒性且常温下萃取效率较 低，使得测定的叶绿素a偏低，不利于评测水体富营养化程度。研究一种新的提取、分析测 定叶绿素a的方法，降低传统研磨法萃取效率低、提取不完全、对人体有毒害性的缺点，对 监测水体富营养化程度，治理水体富营养化，修复受损水环境具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种新的富营养化水体中浮游植物叶绿素a的 分析测定方法，以弥补传统的水体中浮游植物叶绿素a检测方法所存在的提取不完全、有 毒、操作过程复杂等缺陷，以实现高效、快捷、准确、环保地测定水体中浮游植物所含叶绿素 a的含量。本专利技术将传统的研磨法的主要工序加以改进，摒弃研磨工序，使用热乙醇替代丙 醇，引入水浴和超声工序，提高叶绿素提取和萃取效率，从而达到高效准确测定富营养化水 体中叶绿素a的目的。为解决上述技术问题，采用以下技术方案(以下也称热乙醇法)，具体步 骤如下(1)样品的前处理按照传统的检测水体中浮游植物的叶绿素的取样方法采集水样，将200 500ml (计算公式中的％)的水样通过抽滤器抽滤。将抽滤后的滤膜以及附着于其上的浮游 植物置于10 25mL具塞离心管中，然后放入_18°C冰箱中冷冻6 8小时。优选滤膜可采用直径47mm、孔径0. 22 y m的玻璃纤维滤膜，或国产直径60mm、孔径0.45um的混合纤维滤膜，或直径25mm、孔径0. 65 u m的玻璃纤维滤膜，其中直径47mm、孔径 0. 22um的玻璃纤维滤膜的效果最好。此步操作中，采取水样体积也可根据具体水体环境中浮游植物所含叶绿素a的浓 度进行调整，以达到处理后待测样品溶液的浓度在分光光度计允许的测定范围内。(2)样品的萃取取出步骤(1)的具塞离心管恢复至室温状态后，在离心管中加入10mL(计算公式 中的VD 80°C的90%乙醇，80°C水浴2min后，于超声波清洗机内超声lOmin (例如，超声波频 率为40kHz，功率为150W)，超声处理可使浮游植物细胞粉碎更完全，然后避光静置萃取3 5h后以4000r/min的转速离心lOmin，取上清液待测。如果上清液浓度超出分光光度计测定范围，可按照常规分析方法对上清液进行稀 释、浓缩等处理再进行分光测定。(3)上清液的测定及水体中浮游植物叶绿素a的浓度计算取步骤(2)所得上清液在分光光度计上测定上清液的叶绿素a的吸光度。以90% 乙醇作空白吸光度测定，对上清液吸光度进行校正，而后开始测定上清液的吸光度。先在 665nm波长测上清液吸光系数E665，再在750nm波长测上清液吸光系数E75(l，然后在装有上清 液的比色皿中加0. 1 0. 2毫升1. Omol/L盐酸进行酸化，以消除脱镁叶绿素对测定结果的 干扰，得到纯的叶绿素a的吸收值，加盖摇勻，静置lmin后重新在665nm波长测经酸化处理 后的上清液的吸光系数A665，再在750nm波长测其吸光系数A75(l，按下式计算水体中浮游植 物叶绿素a的浓度 ..........................................⑴)式中Chla——叶绿素a浓度(ug/L)；V,—乙醇萃取液定容后的体积(L)；V2——水样的体积(L)；E665，A665——665nm波长处的吸光系数；E750, A750——750nm波长处的吸光系数。与现有测定方法(研磨法)相比，本专利技术的优点如下1.比较叶绿素a含量测定的热乙醇法(即本专利技术方法)和研磨法操作过程，研磨 法的测定过程比较繁杂，其中样品研磨需花费大量时间和精力，且不容易将浮游植物细胞 完全磨碎，影响到叶绿素a的萃取效率，而热乙醇法由于样品经过冷冻和快速热水浴提取， 运用冷热差将浮游植物细胞破碎，再加上超声波的粉碎作用，且热溶液的萃取效果高于冷 溶液，对叶绿素a的萃取较完全，且省时省力。2.研磨法所用的萃取溶剂丙酮的挥发性极强，对人体的毒害远大于乙醇，长期使 用对操作者的毒害较大，用热乙醇法取代研磨法能使操作者处于相对比较健康的实验环 境。同时加入相同量的丙酮和乙醇，后者较前者价格低廉，能降低样品分析测试成本。3.研磨法测定的叶绿素a浓度偏低，其结果不利于作为鉴定富营养化水体的依 据，而热热乙醇法检测限低、检测浓度范围广，结果精准，能正确显示水体的富营养化程度。附图说明图1为本专利技术的流程示意图。 具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。实施例1 上海某城市河道浮游植物叶绿素a测定按照传统的检测水体中浮游植物的叶绿素的取样方法采集上海某城市河道的水 样后，分别使用本专利技术的热乙醇法和传统的研磨法按照下述步骤测定水体中浮游植物的叶绿素a。(一 )对于热乙醇法测定水体中浮游植物的叶绿素a的浓度取200ml水样抽滤(分别使用直径47mm、孔径0. 22 y m的玻璃纤维滤膜和直径 60mm、孔径0. 45 y m的混合纤维滤膜进行抽滤)，将滤膜以及附着于其上的浮游植物置于 10mL具塞离心管中，然后放入-18°C冰箱中冷冻6小时，取出具塞离心管恢复至室温状态 后，向离心管中加入10mL 80°C的90%乙醇，并于80°C水浴2min，再超声lOmin (超声波频 率为40kHz，功率为150W)，而后置于暗处萃取5小时，然后离心10min(4000r/min)，取上清 液在分光光度计上用90%乙醇作为参比液进行比色。具体测定上清液吸光度的做法为 采用1cm光程的比色皿，首先以90%乙醇作空白吸光度测定，对上清液吸光度进行校正，而 后开始测定上清液的吸光度，先在665nm波长测上清液吸光系数E665，再在750nm波长测上 清液吸光系数E75(l，然后在装有上清液的比色皿中加0. 1毫升lmol/L盐酸进行酸化，加盖 摇勻，静置lmin后重新在665nm波长测定经过酸化处理后的上清液的吸光系数A665，再在 750nm波长测其吸光系数A75(l，按式(1.1)计算水体中浮游植物叶绿素a的浓度，相同的水 样重复三次操作，取平均值，即得测定结果。( 二)对于研磨法测定该河道水体中浮游植物的叶绿素a的浓度取200ml水样抽滤(分别使用直径本文档来自技高网...
【技术保护点】
富营养化水体中浮游植物叶绿素ａ的分析测定方法，具体步骤如下： （１）样品的前处理：按照传统的检测水体中浮游植物的叶绿素的取样方法采集水样，将２００～５００ｍｌ的水样通过抽滤器抽滤，将抽滤后的滤膜以及附着于其上的浮游植物置于１０～２５ｍＬ具塞离心管中，然后放入－１８℃冰箱中冷冻６～８小时； （２）样品的萃取：从冰箱取出步骤（１）的具塞离心管恢复至室温状态后，向离心管中加入１０ｍＬ ８０℃的９０％乙醇，于８０℃水浴２ｍｉｎ后，于超声波清洗机内超声１０ｍｉｎ，然后避光静置萃取３～５ｈ后以４０００ｒ／ｍｉｎ的转速离心１０ｍｉｎ，取上清液待测； （３）上清液的测定及水体中浮游植物叶绿素ａ的浓度计算：取步骤（２）所得上清液在分光光度计上测定上清液的叶绿素ａ的吸光度；首先以９０％乙醇作空白吸光度测定，对上清液吸光度进行校正；而后开始测定上清液的吸光度，先在６６５ｎｍ波长测上清液吸光系数Ｅ６６５，再在７５０ｎｍ波长测上清液吸光系数Ｅ７５０，然后在装有上清液的比色皿中加入０．１～０．２毫升１．０ｍｏｌ／Ｌ盐酸进行酸化，加盖摇匀，静置１ｍｉｎ后重新在６６５ｎｍ波长测定经过酸化处理后的上清液的吸光系数Ａ６６５，再在７５０ｎｍ波长测其吸光系数Ａ７５０，按下式计算水体中浮游植物叶绿素ａ的浓度： Ｃｈｌａ＝２７．９Ｖ↓［１］［（Ｅ↓［６６５］－Ｅ↓［７５０］）－（Ａ↓［６６５］－Ａ↓［７５０］）］／Ｖ↓［２］ 式中：Ｃｈｌａ－－叶绿素ａ浓度（ｕｇ／Ｌ）； Ｖ↓［１］－－乙醇萃取液定容后的体积（Ｌ）； Ｖ↓［２］－－水样的体积（Ｌ）； Ｅ↓［６６５］，Ａ↓［６６５］－－６６５ｎｍ波长处的吸光系数； Ｅ↓［７５０］，Ａ↓［７５０］－－７５０ｎｍ波长处的吸光系数。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周雪飞，黄丽，龚本涛，张亚雷，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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